이 프로토콜은 복잡한 3D 바이오 프린팅 실험 전에 민감한 1 차 및 면역 세포에 대한 잠재적 인 세포 독성 효과에 대한 후보 생체 물질 잉크를 선별하는 쉽고 신속한 접근 방식을 제공합니다. 생체 물질 잉크 구조에 면역 세포의 배양 후, 세포는 하류 세포 독성 또는 바이오 마커 분석을 수행하기 위해 부드러운 세척에 의해 구조에서 쉽게 검색 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이식을 위해 향하는 생체 인쇄 조직이 1 차 세포 및 생체 적합성 생체 재료 잉크로 구성되어야하는 조직 공학과 직접 관련이 있습니다.
시작하려면 INKREDIBLE+3D 바이오 프린터에 설치할 바이오 잉크 카트리지를 준비합니다. 먼저, 3밀리리터 생체 재료 잉크 카트리지에서 파란색 엔드 캡을 제거하고 멸균 22 게이지 원식 생체 인쇄 노즐을 바이오 잉크 카트리지의 Luer 잠금 단말에 부착합니다. 인쇄헤드 하나 또는 PH1용 기압 공급 튜브를 카트리지의 반대쪽 끝에 연결하고 연결된 원뿔형 생체 인쇄 노즐을 PH1의 수직 슬롯에 삽입합니다.
다음으로, 인쇄물 아래에 확장된 원물 생체 인쇄 노즐로 PH1의 카트리지를 단단히 고정합니다. PH1의 나사를 손가락이 단단히 고정하여 생체 잉크 카트리지를 제자리에 고정할 때까지 시계 방향으로 조입니다. 3D 바이오프린팅은 PH2가 비어 있으면 수행할 수 있습니다.
바이오 프린터의 전원을 켜고 USB 2.0 케이블을 통해 3D 바이오 프린터에 연결된 PC에서 바이오 프린터 소프트웨어를 실행합니다. 소프트웨어에서 연결 버튼을 클릭하여 3D 바이오 프린터와 동기화합니다. 3D 바이오 프린터의 메인 컨트롤 메뉴에서 세 가지 옵션을 관찰하십시오.
첫째, 바이오 프린트를 준비합니다. 둘째, 유틸리티 메뉴. 셋째, 상태 화면.
준비 된 생체 인쇄 옵션을 선택한 다음 아래로 스크롤하여 홈 축 옵션을 선택합니다. XYZ 축을 성공적으로 보정한 후 인쇄 베드의 높이가 약간 낮아지고 인쇄 헤드가 인쇄 베드의 중심점 위로 이동합니다. 24웰 플레이트에서 바이오프린팅을 위한 시작점 보정을 진행하려면 밀봉된 플라스틱 래핑에서 멸균 24웰 배양판을 제거하고 영구 마커로 플레이트 밑면의 잘 D1의 중심점에 점을 표시한다.
플레이트 커버를 제거하고 인쇄 침대의 왼쪽 왼쪽 모서리에 잘 D1이있는 인쇄 침대에 24 웰 문화 판을 놓습니다. 주 컨트롤 메뉴에서 유틸리티 메뉴를 선택한 다음 축을 이동합니다. PH1의 원물 생체 인쇄 노즐이 잘 D1 아래에 표시된 점 위에 직접 올라갈 때까지 X 및 Y 축을 따라 인쇄 헤드를 1밀리미터 단위로 이동합니다. 필요한 경우 인쇄 헤드를 0.1밀리미터 단위로 이동하여 원물 바이오 프린팅 노즐의 위치를 도트 위에 미세 조정합니다.
3D 바이오 프린터의 제어판 화면에 표시된 대로 잘 D1의 중앙을 직접 위에 있을 때 원물 생체 인쇄 노즐의 X 및 Y 좌표를 기록하고 좌표를 표시합니다. 다음으로, 잘 D1의 바닥이 거의 인쇄 헤드 하나에 설치된 원뿔 형 바이오 프린팅 노즐을 만질 때까지 1 밀리미터 단위로 인쇄 침대를 올립니다. 필요한 경우 인쇄 베드의 움직임을 0.1밀리미터 단위로 미세 조정합니다.
유틸리티 메뉴에서 Z 축 보정 옵션을 선택하고 추가로 Z 보정 옵션을 선택하고 확인합니다. 메인 메뉴로 돌아가 준비 된 바이오 프린트 옵션을 선택합니다. 아래로 스크롤하여 교정 Z 옵션을 선택합니다.
올바른 시작점 좌표로 24웰 플레이트 기하학적 코드 또는 G 코드를 업데이트합니다. 바이오 프린트 소프트웨어에서 제공된 24웰 G 코드 파일을 엽니다. 이전 단계에서 얻은 값으로 줄에 X 및 Y 좌표를 업데이트하고 새 이름으로 파일을 저장합니다.
공압 펌프가 INKREDIBLE+3D 바이오 프린터의 후방 공기 섭취 포트에 단단히 연결되어 있는지 확인하고 켭니다. INKREDIBLE+3D 바이오 프린터의 오른쪽에 있는 전방 제어 노브를 꺼내십시오. 바이오 프린터 전면에 위치한 PH1 및 PH2용 디지털 압력 게이지가 각각 0킬로파스칼에 가깝게 읽히도록 합니다.
PH1의 왼쪽 게이지에 표시된 압력이 12킬로파스칼에 도달할 때까지 전방 제어 노브를 시계 방향으로 천천히 회전합니다. 접힌 티슈 페이퍼 나 설치된 카트리지의 인쇄 노즐 아래에 방수 밀봉 필름 을 놓고 인쇄 노즐을 만지지 않도록주의하십시오. 3D 바이오 프린터의 주요 제어 메뉴에서 생체 인쇄를 준비하십시오.
PH1로 이동하여 켜기를 선택합니다. 바이오 잉크가 인쇄 노즐에서 돌출되기 시작합니다. 필요한 경우, 바이오 잉크가 연속 필라멘트에서 압출될 때까지 제어 노브를 시계 방향으로 회전시켜 압출 압력을 증가시키고 새로운 압력 설정을 기록한다.
바이오 잉크의 압출을 중지하려면 PH1을 끄십시오. 인쇄 침대에서 압출 된 바이오 잉크가 들어있는 티슈 페이퍼 또는 필름을 제거하고 바이오 프린터 문을 닫습니다. 24웰 플레이트 형식으로 직선 하이드로겔 기판의 3D 바이오프린팅을 수행하려면 메인 컨트롤 메뉴에서 유틸리티 메뉴를 선택한 다음 바이오 프린터 소프트웨어가 인쇄를 위해 G 코드 파일을 3D 바이오 프린터로 전송할 수 있도록 사용하지 않도록 설정합니다.
바이오 프린터 소프트웨어의 로드 버튼을 클릭하고 업데이트된 24웰 플레이트 G 코드 파일을 선택합니다. 소프트웨어의 오른쪽 제어판에서 인쇄 미리 보기 탭을 선택하고 인쇄 버튼을 클릭하여 잘 D1에서 바이오 프린팅을 시작합니다. 직선 구조의 바이오 프린팅이 완료되면 뚜껑으로 24웰 플레이트를 덮고 클래스 II 생물 안전 캐비닛으로 이동합니다. 각 직사각형 구조에 멸균 50 밀리몰라 칼슘 염화 칼슘 용액 2방울을 담그고 실온에서 5분간 배양합니다.
각 우물에서 염화물 칼슘 용액을 조심스럽게 흡인시키고 1X PBS의 1밀리리터에 한 번 헹구어 염화칼슘을 제거합니다. 생체 인쇄 하이드로겔 구조의 탈수를 방지하기 위해 골수 유래 돛대 세포가 구문에 시드될 때까지 3D 생체 인쇄 직사각형 구조를 신선한 1X PBS로 유지합니다. 유동 세포측정에 의해 분석된 BMMC의 전방 및 측면 산란 파라미터에 기초하여, CNC 농도가 가장 높은 하이드로겔 기판은 CNC 아가로즈 D-mannitol 하이드로겔 기판이 없는 경우 배양된 BMMC와 비교하여 BMMC의 원모 크기 또는 세분성을 변경하지 않은 것으로 관찰되었다.
BMMC의 투과성 유동 분석에서 요오드데를 프로비티드화하는 것은 CNC 농도 중 어느 것도 BMMC 생존가능성에 어떤 악영향을 미치지 않는다는 것을 입증했다. CNC 아가로즈 기판은 CNC 농도에서 마스트 세포 바이오마커의 발현을 2.5%보다 높거나 2.5%로 증가시켰지만, 이러한 수용체의 발현 수준은 2.5%와 12.5%CNC 사이에서 비교적 일관되게 유지되어 CNC의 농도와 무관하다는 효과를 시사한다. XTT 분석은 3D 생체 인쇄 하이드로겔 스캐폴드에서 배양된 BMMC의 대사 활성이 모든 테스트 된 시간 지점에서 약 100 %로 비교적 일관되게 유지되었다는 것을 입증했습니다.
마찬가지로, LDH 릴리스 및 PI 염료 배제 아세서는 BMMC의 생존 가능성에 큰 변화가 없음을 밝혔습니다. 돛대를 회수할 수 있는 용이성은 세포 기능의 어떤 양상든지를 추가로 연구하기 위하여 생물학 적인 약서의 넓은 범위에 의해 탐구될 수 있습니다.
