당사의 프로토콜은 자연 조직에 밀접한 영향을 미치는 3D 생체 공학 모델을 제공합니다. 이는 신경모세포종 치료 및 진단을 위한 새로운 치료법과 바이오마커를 발견하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 주요 장점은 배치 간 일관성을 달성하는 재현 가능한 기술을 사용하여 종양 미세환경을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 실험 조건을 생성한다는 것입니다.
당사의 스캐폴드 방법은 첫째, 신경모세포종에 대한 새로운 치료법을 식별하고, 둘째, 개별 환자 반응을 더 잘 예측하기 위해 환자 유래 세포를 통합하는 데 활용할 수 있습니다. 시작하려면 PBS에 저장된 스캐폴드를 층류 후드에 넣습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 모서리에서 비계를 부드럽게 들어 올리고 측벽을 눌러 과도한 PBS를 제거합니다.
그런 다음 광택 층이 아래를 향하도록 비접착식 24웰 플레이트의 웰 중앙에 스캐폴드를 놓습니다. 세포주, 파종 밀도 및 시점의 세부 사항으로 플레이트에 라벨을 붙입니다. 한 번에 하나의 파종 밀도의 세포로 작업하고 나머지 세포는 사용할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 섭씨 37도로 유지합니다.
스캐폴드에 셀 부착을 위해 멸균 팁이 있는 P20 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 완전히 혼합하고 각 스캐폴드의 중앙에 관련 셀 현탁액 20마이크로리터를 추가하여 셀 현탁액이 웰의 측벽이나 바닥이 아닌 스캐폴드 상단에 유지되도록 합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 95% 습도에서 3-5시간 동안 부착시킵니다. 배양이 끝나면 P1000 피펫을 사용하여 각 웰에 1mL의 예열된 성장 배지를 천천히 추가하여 스캐폴드의 변위를 방지하고 플레이트를 밤새 배양합니다.
처음에는 2-3일마다 스캐폴드를 관찰하여 스캐폴드 내에서 세포가 증식함에 따라 성장 배지의 색상 변화를 확인합니다. 슬로우 모드의 10밀리리터 피펫 건을 사용하여 웰에서 사용한 배지 1밀리리터를 제거하고 버립니다. 컨디셔닝된 배지를 실험에 사용하는 경우, 생물학적 복제물의 사용된 배지를 15밀리리터 원심분리 튜브에 모으고 원심분리를 통해 세포 파편을 펠릿으로 떨어뜨립니다.
상층액을 새 튜브로 옮기고 튜브를 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 피펫 건을 드립 모드로 설정한 후 예열된 성장 배지 2ml를 스캐폴드에 부드럽게 추가합니다. 스캐폴드 함유 플레이트를 배양하고 시연된 대로 원하는 성장 기간 동안 신선한 배지를 보충합니다.
층류 후드에서 0.2마이크로미터 멸균 필터를 통해 원심분리 튜브로 여과하여 적절한 세포 생존도 분석 시약을 멸균합니다. 멸균 용액, 완전한 성장 배지 및 멸균 PBS를 섭씨 37도의 수조에서 예열합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 분석할 스캐폴드를 새 24웰 플레이트로 옮기고 플레이트에 모든 관련 세부 정보를 라벨링합니다.
예열된 성장 배지 900마이크로리터를 각 우물에 추가합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 멸균 세포 생존도 시약을 각 웰에 추가합니다. 음성 대조군의 경우, 900 마이크로리터의 배지와 100 마이크로리터의 멸균 세포 생존도 시약을 스캐폴드가 없는 웰에 추가합니다.
플레이트의 뚜껑을 다시 덮고 약 3분 동안 플레이트를 부드럽게 흔들어 희석된 세포 생존도 시약을 웰 전체에 분산시킵니다. 이산화탄소 37%와 습도 5%로 접시를 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼낸 후 몇 초 동안 플레이트를 부드럽게 흔들어 텍스트 원고에 설명된 대로 트리플리케를 생성합니다.
100 마이크로리터의 배양된 배지 및 시약을 24웰 플레이트의 한 웰에서 반투명 96웰 플레이트의 한 웰로 옮겨 기술적 삼중을 생성하고, 하나의 웰에 대해 이 단계를 총 3회 수행합니다. 96웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 세포 생존도 시약을 빛으로부터 보호합니다. 700웰 플레이트의 스캐폴드에서 나머지 24마이크로리터의 배지와 시약을 제거하고 폐기합니다.
멸균 PBS 1m리터로 각 비계를 두 번 세척합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 및 600 나노미터에서 흡광도를 측정하고 제조업체의 권장 사항에 따라 세포 생존도 시약의 감소율을 계산합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 세포 생존율 결과를 통계적으로 분석합니다.
생물학적 삼중 값을 입력하여 오차 막대를 생성하고 분석 변동성을 나타냅니다. 적절한 생물통계학적 소프트웨어를 사용하여 실험 기간 동안 세포 생존율의 변화를 조사하기 위해 분산 검정의 일원 분석을 수행합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 그래프의 시점 간에 상당한 차이를 나타냅니다.
스캐폴드에서 성장한 두 개의 신경모세포종 세포주, KellyLuc 및 IMR32의 생존력을 평가했습니다. 증가된 세포 밀도는 시간이 지남에 따라 세포 생존도 시약의 더 많은 감소를 초래했습니다. 스캐폴드에서 추출한 DNA를 정량화하여 스캐폴드에서의 세포 성장을 간접적으로 측정하고, 샘플당 세포를 계산하였다.
IMR32 세포는 시간이 지남에 따라 증가된 성장을 보였고, 그 다음에는 KellyLuc 세포가 성장했습니다. 스캐폴드에서 세포의 성장 형태 및 분포는 헤마톡실린, 에오신 및 면역조직화학 염색에 의해 육안으로 평가되었습니다. KellyCis83 세포는 덜 침습적인 Kelly 세포주보다 더 빠르게 성장하고 두 스캐폴드 조성물 모두에 더 깊이 침투했습니다.
나노 하이드록시아파타이트에서 성장한 IMR32는 14일 동안 크고 조밀하게 채워진 클러스터와 대조적인 성장 패턴을 보여주었습니다. 세포 특이적 형질은 면역조직화학 염색에 의해 모니터링된 후 팔로이딘 및 DAPI 염색에 의해 모니터링되었으며, 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드의 Kelly 및 KellyCis83 세포에서 액틴의 풍부함이 관찰되었습니다. 시험관 내 세포 활성 평가를 위해 분비된 크로모그라닌 A 수준을 측정하고 콜라겐-글리코사미노글리칸 및 콜라겐 나노-하이드록시아파타이트 스캐폴드에서 성장한 세포가 기존 2D 배양에서 성장한 세포에 비해 더 많은 크로모그라닌 A를 생성했습니다.
화학저항성 KellyCis83 세포주는 켈리 세포주보다 더 많은 크로모그라닌 A를 분비했습니다. 세포 부착 후 세포는 다양한 치료제로 치료할 수 있습니다. 이는 기존의 2D 배양보다 약물에 대한 세포의 반응에 대해 생리학적으로 더 관련성이 높은 결과를 제공할 것입니다.
이 기술을 통해 연구자들은 암세포가 종양 미세환경 내에서 어떻게 행동하고 자극에 반응하는지 더 잘 탐구할 수 있으며, 반응에서 치료제 또는 다른 세포 유형과의 상호 작용에 이르기까지 다양합니다.
