2차원 세포 배양은 생체 종양 성장에서 적절히 모방하지 않습니다. 개선하기 위해 스페로이드를 사용하여 3D 절차가 개발되었습니다. 우리의 3D 교모세포종 스페로이드 기반 분석은 건강한 뇌종양 환경에 뇌종양 침입을 조사하는 데 특히 적합합니다.
3차원 배양 모델은 약물 효과의 보다 엄격한 평가를 허용하는 종양의 다세포 아키텍처, 이질성 및 대사 상태를 재구성하는 데 사용될 수 있다. 우물의 바닥을 만지거나 상퍼를 완전히 제거하여 얼음에 젤을 유지하고 세포를 젤에 신속하게 추가하지 않도록하십시오. 균일하게 크기의 종양 스페로이드를 생성하기 위해 먼저 PBS의 5 밀리리터로 관심있는 종양 세포 배양을 세척하고 세포를 0.5 내지 1 밀리리터의 해리 효소로 치료한다.
섭씨 37도에서 5분 후, PBS의 4~4.5밀리리터로 반응을 멈추고 분리된 세포를 완전한 성장 배지 10밀리리터를 함유한 15밀리리터 원컬튜브로 이송한다. 카운트 후, 완전한 성장 배지의 8 밀리리터 당 1회 10에서 여섯 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 2%의 메틸셀룰로오스 농도의 2밀리리터로 보충하고 서스펜션을 멸균 시스템 용기로 옮길 수 있다. 그런 다음 96웰 라운드 하단 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터의 셀을 추가하고 플레이트를 37도 5% 이산화탄소 인큐베이터에 3~4일 동안 넣습니다.
침입 분석을 수행하기 위해 종양 세포가 균일하게 크기의 스페로이드를 형성했을 때 각 세포 구조를 500 마이크로 리터 튜브로 옮기고 PBS의 200 마이크로 리터로 스페로이드를 한 번 씻으십시오. 두 번째 세척 후, 새로 준비된 콜라겐 매트릭스의 100 마이크로리터로 스페로이드를 조심스럽게 옮기고 각 스페로이드 현탁액을 평평한 바닥 96웰 플레이트의 중앙에 넣습니다. 섭씨 37도에서 30분 간 배양한 후, 각 웰의 젤 위에 100마이크로리터의 완전한 성장 매체를 추가합니다.
종양 세포 침략의 제일 화상 진찰을 위해 각 우물의 중앙에 모든 스페로이드를 두십시오. 이온 분석을 수행하기 위해 종양 세포가 균일하게 크기의 스페로이드를 형성했을 때, 섭씨 37도에서 30 분 동안 성장 배지에서 트리겔의 밀리리터 당 0.2 밀리그램으로 6 웰 플레이트를 코팅합니다. 인큐베이션이 끝나면, 교유를 제거하고 각 우물에 완전한 성장 매체의 2 밀리리터를 추가하십시오.
50 마이크로리터 부피로 둥근 바닥 플레이트에서 스페로이드를 6웰 플레이트의 개별 우물로 옮기고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 24시간 동안 배치한다. 다음 날, 37섭씨에서 30분 동안 Hoechst 밀리리터당 10나노그램으로 스페로이드를 얼룩지게 합니다. 침입 또는 마이그레이션 분석 후 이미지 수집의 경우, 비디오 카메라가 장착된 브라이트필드 공초점 현미경의 무대에 판을 배치하고 적절한 실험 기간 동안 이미지를 얻을 수 있습니다.
반자동 방식으로 이미지를 분석하려면 이미지를 피지로 가져오고 플러그인, 매크로, 대화형 통역사를 클릭합니다. 적응된 보라색 루프를 복사하여 붙여넣습니다. 보라색 문장을 유지하고 필요에 따라 관심의 녹색 문장을 추가합니다.
그런 다음 각 스페로이드의 영역을 측정하려면 분석 및 측정을 클릭합니다. 구형 구조의 뚜렷한 영역에서 저산소증을 측정하기 위해, 탄산 안수제 IX 염색은 저산소 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 대표적인 분석에서, 더 많은 탄산 안수제 IX 양성 세포가 스페로이드 센터에서 관찰되었다.
스페로이드 코어에 위치한 저산소 세포는 코어를 둘러싼 세포보다 더 당화적인 경향이 있다. 미토콘드리아는 추가 분석을 위해 전자 현미경 검사법에 의해 심화될 수 있다. 스페로이드 직경은 3D 세포 구조를 구성하는 세포의 밀도와 직접 상관관계가 있으며 피지 매크로는 각 스페로이드 내의 세포의 증식, 침입 또는 이주를 정량화하는 데 사용될 수 있다.
스페로이드 코어의 증가는 세포 증식의 자극을 반영한다. 미토콘드리아 호흡기 사슬의 복잡한 I의 억제시, 미토콘드리아내 ATP 생산의 대부분은 72시간 후에 20%까지 증식을 감소시키는 손상된다. 염화수소 치료는 콜라겐 타입 I의 침입을 24시간 동안 향상시키지만, 처리되지 않은 스페로이드를 조절하는 것에 비해 스페로이드의 철새 면적을 1.5배 감소시킨다.
라이브 이미징에 의해 평가된 바와 같이, 스페로이드는 높은 내부 역학을 보여주고 빨리 움직입니다. 스페로이드의 크기는 상대적으로 균일해야하며 최상의 이미징 결과를 위해 우물의 중심으로 스페로이드를 조작하기 위해주의를 기울여야합니다. 이 방법은 또한 종양 세포 증식, 이주 및 죽음뿐만 아니라 세포 외 매트릭스, 세포 수용체 또는 관심의 세포 내 단백질의 발현을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
상기 스페로이드는 캡슐을 제거하면 세포 표면 장력 증가의 효과를 캡슐화할 수 있고, 세포 표면 장력의 효과를 조사할 수 있다.
