우리의 프로토콜은 C.elegans 운동을 정량화하는 두 가지 분석서를 제공합니다. 이러한 방법은 근위축성 측삭 경화증 또는 ALS의 모델에 의해 전시된 것과 같은 운동성 표현형을 평가합니다. 방사형 운동 분석법은 고체 표면에서 크롤링을 감지하는 비용 효율적이고 쉬운 방법입니다.
수영 분석은 액체에서 스래싱 움직임을 편견 없이 감지하기 위해 컴퓨터 기반 추적을 사용합니다. 이러한 방법은 C.elegans의 이동 차이를 정량화하는 데 유용합니다. 우리는 ALS를 공부하지만, 그들은 변경 된 운동성으로 어떤 변형에 사용할 수 있습니다.
NGM 분석 판을 거꾸로 뒤집습니다. 그리고 C.elegans 균주에 대한 식별자로 하단에 레이블을 지정합니다. 거꾸로 접시의 중앙에 마커와 작은 점을 확인합니다.
해부 현미경으로 작업하는 동안, 분석 판의 중심으로 벌레를 전송. 그리고 30 분 동안 타이머를 설정합니다. 뚜껑을 접시에 다시 놓고 따로 둡니다.
모든 균주가 지정된 분석 판에 올 때까지 웜을 계속 이송합니다. 30분 후, 뚜껑을 제거하고 플레이트를 해부 현미경 아래에 내려놓음으로써 첫 번째 플레이트점수를 시작하십시오. 모든 웜이 Auger를 통해 볼 때까지 현미경 초점을 조정합니다.
중앙 점에서 다른 색깔의 펠트 팁 펜을 사용하여 각 웜의 위치에 작은 점을 놓습니다. 일부 웜이 끝날 수 있기 때문에 접시의 가장자리를 확인하십시오. 또한 중앙 지점에서 이동하지 않은 웜 수를 계산하고 기록합니다.
각 웜의 중앙 지점에서 최종 위치 표시까지의 거리를 측정하고 눈금자를 사용하여 거리를 기록합니다. 첫 번째 웜 포인트는 대시로 표시됩니다. 시계 방향으로 플레이트를 회전하여 각 점의 길이 데이터를 연속적으로 기록합니다.
관련 소프트웨어를 열어 비디오를 설정하고 녹화합니다. 동영상 캡처 아이콘을 클릭합니다. 조광기 노브를 누르고 시계 방향으로 돌려 빛을 조정합니다.
비디오 캡처 창에서 설정 탭을 클릭하고 비디오 모드를 조정하여 2456x2052_Mono8 프레임 속도를 14로 조정하여 흑백으로 출력합니다. 0.00300초의 노출. 1dB로 이동합니다.
감마 하나. 그리고 180으로 회전합니다. 캡처 탭으로 다시 이동하여 레코딩 폴더를 선택하고 파일 접두사 텍스트 상자에 입력하여 파일 이름을 할당합니다.
버퍼와 같은 다른 캡처 설정을 128프레임으로 설정하고 지속 시간을 1분으로 설정합니다. 장치 스테이지에 점등된 분석판을 배치하고 비디오 캡처 화면에서 중앙에 배치한 다음 뚜껑을 제거합니다. 마이크로피펫을 사용하여 M9 1 ml에서 약 50개의 벌레를 분석 판에 씻습니다.
접시를 부드럽게 소용돌이어 동물을 중앙으로 데려오거나 마이크로 파이프를 사용하여 M9 몇 방울을 추가하여 동물을 분리합니다. 벌레가 수영할 수 있도록 타이머를 60초 동안 설정합니다. 디스플레이가 과다 노출없이 가능한 한 밝을 수 있도록 라이트 노브를 조정합니다.
디스플레이를 보면서 카메라의 렌즈 본체에 초점을 맞추는 링을 돌리면 카메라 초점을 수동으로 조정합니다. 60초 후에 레코드 버튼을 누르면 워크플로 메뉴 가져오기 이미지 시퀀스의 첫 번째 단추를 선택하고 비디오를 찾아 두 번 클릭합니다. 워크플로 메뉴에서 시퀀스 정보 설정"새 메뉴 창에서 명명 체계를 확인하고 메모를 추가하고 메타데이터의 유효성을 검사합니다.
이미지 조정을 선택합니다"라는 새로운 팝업 메뉴가 열립니다. 배경 스무딩을 10으로 설정하고, 가우시안 스무딩을 5개로 설정하고, 구멍을 2개로 채우고, 작은 오브젝트 필터를 0으로 채우고, 일체형 유도체 세분화를 건너뛰면 이미지 처리 설정을 조정합니다. 동물이 완전히 녹색으로 채워지지만 배경과 구별되는 임계값 수준을 조정합니다.
그런 다음 "적용"워크플로 메뉴에서 감지 및 추적을 선택하고 검색 탭에서 웜 감지"버튼을 클릭합니다. 추적 탭으로 이동합니다. 추적 매개 변수에서 역추적 사용"을 확인하고 이미지 가장자리에서 추적 웜의 선택을 취소합니다.
최대 추적 가설을 5로 설정합니다. 추적 모드를 수영으로 설정합니다. 고급 설정 섹션으로 이동하여 프레임 웜이 경계를 50으로 터치할 수 있도록 설정합니다.
프레임 웜은 500개에 겹칠 수 있습니다. 위치 허용 오차는 0.50입니다. 그리고 0.50에 모양 허용 오차.
이러한 설정을 저장하고 실험에서 모든 비디오에 배포하여 구성으로 저장합니다. 왼쪽 상단 아이콘 메뉴의 구성 관리자로 이동하여 저장"아이콘을 클릭합니다. 이 구성에 이름과 설명을 제공합니다.
그리고 Okay"워크플로 우위 메뉴에서 프로젝트 저장을 클릭합니다"워크플로 메뉴로 이동하여 일괄 처리"아이콘을 클릭하여 비디오를 추적합니다. 이 일괄 처리 메뉴의 파일 선택 섹션 아래에 있는 "추가" 단추를 클릭합니다. 처리할 모든 프로젝트 파일을 탐색하고 선택합니다.
그런 다음 "시작"버튼을 클릭하고 첫 번째 파일의 녹색 진행률 표시기를 기록합니다. 모든 파일을 처리하도록 허용합니다. 읽은 모든 파일이 완료되면 소프트웨어를 닫습니다.
데이터 분석 선택"트랙 요약으로 이동합니다. 오른쪽 하단의 내보내기"버튼을 사용하여 스프레드시트가 읽을 수 있는 형식으로 데이터를 내보냅니다. 회전 카운트"와 트랙 기간을 사용하여 스프레드 시트 함수를 사용하는 각 트랙의 분당 회전을 계산합니다.
5개의 다른 균주의 발달 단계 L4 애벌레의 자극되지 않은 분산은, 방사형 운동 분석체를 사용하여 측정되었다. 그리고 분당 마이크로 미터로 그래프로 이동. 막대 그래프로 표시되는 데이터는 균주 간의 상대적 차이를 더 선명하게 만듭니다.
그래프 내에 플롯된 각 웜의 최종 변위는 모집단 내의 변형을 더 잘 시각화할 수 있도록 합니다. 액체의 스래싱 또는 기복 주파수의 관점에서 수영의 속도, 편견 컴퓨터 지원 점수 및 분석을 사용하여 측정되었다. 그리고 분당 스래시로 그래프.
막대 그래프 데이터를 사용하면 균주 간의 상대적 차이를 쉽게 볼 수 있습니다. 채점된 각 개별 웜의 데이터가 그래프 내에 플롯되는 반면, 인구 내의 변동이 더 잘 시각화될 수 있습니다. 방사형 운동 분석에서, 온화한 TDP-43 균주는 야생 형 N2 균주와 크게 다르지 않았다.
그러나, 수영 분석에서, 온화하고 강한 TDP-43 균주는 야생 형 N2와 크게 다르지 않았을뿐만 아니라, 또한 서로 크게 달랐다. ALS 돌연변이 TDP-43 균주는 방사형 운동으로 인해 심각한 크롤링 장애를 가지며 액체에 부딪히지 않습니다. 타우 표현 균주는 방사형 운동에서 심각한 손상을 가지고 있지만 수영 분석에서 분쇄 할 수 있습니다.
이러한 메서드에서 고려해야 할 가장 중요한 측면은 복제 간에 일관된 컨트롤을 유지하는 것입니다. 이를 통해 운동성의 변화는 환경 조건이 아닌 현상차이에 의해 야기됩니다. 이러한 방법은 두 가지 주요 C.elegans 운동성 패러다임의 포괄적인 평가를 제공합니다.
후속 방법은 추가 행동 특성화를 포함할 수 있습니다., 생 화 확 적인 분석, 또는 근육 또는 뉴런 기능의 조사.
