Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

동물 사용에 대한 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 관리 및 사용을위한 설명서에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다 실험 동물의. 1. 뇌 추출, 단면 및 조직 준비 <ol><li> 깊이 5 분 동안 CO 2 질식으로 안락사에 의해 야생형 마우스 스트레인 C57BL / 6 희생. 자궁 전위에 의해 죽음을 확신합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 헤드를 청소합니다. </li><li> 제 두개골을 노출시키기 위해 머리 위쪽부터 떨어져 피부를 당겨 멸균 가위 집게를 사용하여 두개 절제술을 수행한다. </li><li> 그런 다음, 두개골이 노출 될 때, 뼈 조각별로 조각을 벗겨 후방 측에서 시작하여 전방쪽으로 이동하여 두개골을 제거합니다. 뇌 심실을 파괴하지 않도록주의해야합니다. </li><li>전체 뇌를 수집합니다. </li><li> 페니실린 10000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 및 예열 10,000 ㎍ / ml를 함유 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액을 함유 100mm 배양 접시에서 뇌를 놓고 37 ° C까지. </li><li> 날카로운 블레이드와 손으로 정중 시상면에 뇌를 슬라이스하고, vibratome를 사용하여 각 반에서 첫 번째 100-200mm 섹션을 구하십시오. </li><li> 미리 예열 37 ° C, 인산 완충 식염수 (1X PBS) 용액으로 뇌 조직을 헹군다. </li><li> 즉시 DMEM / 높은 포도당 미디어 37 ℃로 미리 예열 뇌 섹션을 배치합니다. </li></ol> 2. 라이브 영상 구성 및 설정 <ol><li> DMEM / 높은 포도당 미디어 1 ㎖를 포함 30mm의 유리 바닥 배양 접시의 뇌 조직 섹션을 배치합니다. 95 % / 5 % O 2 / CO 함량이 37 ° C, (도 1의 현미경 밀폐 챔버 환경을 조정 </str옹&gt;). </li><li> 60X 대물 오일 침지 렌즈를 사용하여, 제 60X 대물 렌즈의 기름 방울을 배치하고 정기적 DIC와 셀에 초점 뇌실막 세포 / 섬모 영상 수집은 광을 투과. </li><li> 섬모 구타 영역에서 기포 운동 종류를 만들 때 다음, 뇌실막 운동성 섬모의 위치 기준으로 DMEM 거품 이동 방향을 따른다. DIC 필터를 사용하여 뇌의 뇌실의 운동성 섬모와 건강한 세포를 포함하는 영역을 선택합니다. 뇌실막 섬모가 발견되면, 빛을 조정하고 양호한 화상을 얻는 데 초점을 맞춘다. </li><li> MetaMorph로부터 촬상 소프트웨어를 이용하여 특정 용도에 따라 라이브 영상 파라미터를 설정한다. 본 데모에서는 객관적인 60X 5 ~ 10 밀리 초 노출 시간과 함께 1 × 1 카메라 비닝 세트 이십사 비트 이미지를 획득. </li><li> 최소 특급을 위해 최적 수준으로 현미경 조리개를 열어 DIC 이미지 수집osure 시간. 지체없이 신속하고 즉시 이미지 수집을 제공하기 위해 카메라에 라이브 영상 스트림을 관찰한다. 충분한 화상 콘트라스트를 획득하기 위해 최소 노출 시간의 요건에 기초하여 섬모 박동의 속도를 계산한다. </li></ol> 3. 데이터 시각화 및 분석 <ol><li> 1 분에 구타의 수를 계산하여 섬모의 구타의 수를 계산합니다. 비디오의 속도를 감소시키고 셀 카운터 또는 유사한 공구를 사용하여 비트 수를 카운트하여 수행. </li><li> 매질의 주파수를 계산하기 위해, 비디오 초의 수를 얻기 위해 획득 프레임 또는 시간 경과 화상의 수에 의해 기록되는 노광 시간을 곱한다. (예 : 노출 시간 5 밀리 초 200 프레임 = 1000 밀리 초 또는 1 초). </li><li> 초 당 하나의 박동 수로 표현되는 주파수를 획득하기 위해 1 초 매질의 수를 계산한다. 1 초 시간 간 동안 섬모의 구타의 수를 분할하여이 작업을 수행발은 (예 : 섬모는 = 1 초 5 밀리 초, 즉 5 밀리 X 200 프레임의 노출 시간 기록 (200) 프레임 비디오에서 50 회 박동, 지금은 1 초 = 50 Hz에서 50 비트를 분할). </li><li> 모두 전원 및 복구 스트로크하는 동안 뇌실막 섬모에 의해 촬영 경로를 평가하여 섬모 치는 각도를 계산합니다. 약간의 수정 (11)와, 이전에 기술 된 방법에 따라이 작업을 수행합니다. 각각의 섬모 운동의 정확한 완전한 비트주기 동안 관찰된다. </li><li> 모니터 위에 배치 아세테이트 시트에서 뇌실막 가장자리와 동력 행정의 개시시 섬모의 중심선 위치를 통해 수직 라인을 따라 수평 라인을 그린다. </li><li> 이 동력 행정 중에 전진으로 프레임에 의해 섬모 프레임의 정확한 위치를 플롯. 유사한 방식으로, 복구 행정 중에 섬모의 운동을 플롯. </li><li> T시의 중간 선에서 섬모의 최대 편차에서 섬모 치는 각도를 계산동력 행정뿐만 아니라 복구 스트로크 그가. </li></ol> 4. 칼슘 신호 기록 <ol><li> 뇌를 슬라이스 한 후, 간단히 1X PBS 또는 둘 베코의 PBS (PH 7.0)와 뇌 조각을 씻어. 형광 소광을 방지하고, 양호한 신호 대 잡음비를 구하는 신선한 FLUO-2를 준비한다. </li><li> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 FLUO-2 액 1 mM의 스톡 용액을 준비 혼합 FLUO-2를 균일 DMSO에 용해 될 수 있도록 적어도 5 분 동안 용액을 소용돌이. </li><li> 2 % B27로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 500ml에 FLUO-2 원액 희석하여 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 37 ° C로 미리 예열. 주 : B-27 비타민 A, 항산화 칵테일 및 해마 및 기타 CNS 신경 세포의 단기 또는 장기 생존 능력을 지원하기 위해 사용되는 인슐린을 포함하는 최적화 된 무 혈청 보충. </li><li> 즉시 유리 - 바닥 플레이트에 37 ° C에서 30 분 동안 20 ㎎ / ㎖ FLUO-2 뇌 슬라이스 배양한다. </li><li> 칼슘 형광체 FLUO-2의 최적 로딩 농도를 결정하고, ATP와 칼슘 염료 세포 독성 공격 세포를 방지하고, ATP에 응답하여 시간 경과와 칼슘 신호의 피크 진폭을 측정함으로써 세포 생존을 확인. </li><li> 488 nm의 515 nm의 각각 (영화 2)의 여기 및 방출 파장, 1 초 (초당 200 프레임)의 최소 5 밀리의 캡처 속도로 칼슘 진동에 대한 비디오를 기록합니다. </li><li> 자가 형광 또는 이동 유물에서 FLUO-2 칼슘 신호를 구별하기 위해, 515 nm에서 방출 강도가 개별적으로 모니터링되어 있는지 확인합니다. 참고 : FLUO-2는 세포 내 칼슘을 정량화하기에 적합한 칼슘 fluoremetric 없습니다. 그러나, 칼슘 진동 빨리 칼슘 변화를 감지하는 우수한 동적 칼슘 염료이다. 보다 정확한 칼슘 정량,의 Fura-2를 권장합니다. 그러나의 Fura-2의 동적 변경은 그 비율 적으로 한정염료의 특성. </li><li> 정확한 무료 세포 내 칼슘의 값을 계산하기 위해 제조업체에서 제공하는 공식을 따릅니다. 예 [칼슘 2 +] = K의 D × (R - R 분) / (R 최대 - R). K (D)가 해제 칼슘으로부터 염료의 해리 상수이고, R은 488에서 측정 된 형광이고, R과 R 분의 최대 최소 및 최대 이온 농도 12에서 형광 비율이다. </li></ol> 5. 면역 형광 현미경 <ol><li> 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 10 분 동안 2 % 수 크로즈를 함유하는 인산염 완충 식염수와 뇌 부분을 수정. 또한, 저온 유지 장치를 사용하여 50mm의 섹션으로 4 % PFA 다음과 섹션 전체 뇌를 해결. </li><li> 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오. </li><li> soluti와 뇌 조각을 품어5 분 1X PBS에서 0.1 % 트리톤-X의에, 다음 5 분 때마다 1X PBS로 3 회 씻어. </li><li> 밤새 4 ℃에서, 실온 (RT) 또는에서 1 시간 동안 1X PBS에 10 % FBS에서 5000 : 마우스 일차 항체로 뇌 슬라이스 부화 1의 희석에 사용 - 튜 불린을 antiacetylated. </li><li> 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오. </li><li> 이차 항체의 뇌 슬라이스 부화 1의 희석 레세 항 - 마우스 IgG : RT에서 1 시간 동안 1X PBS 용액 500 10 %의 FBS. </li><li> 5 분 핵 (또는 DNA) 13 얼룩 4 &#39;, 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)와 섹션 Counterstain과 형광 현미경으로 관찰하기 전에. 가능한 최소 노출 시간 구간 바로 광표백 화상을 최소화. </li></ol>

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

실시간 이미징과 뇌 심실 내에 뇌실막 섬모의 신속하고 민감하게 관찰을 제공 형광 현미경 모두 마우스 뇌 조직의 준비를위한 프로토콜은 여기에 설명한다. 이 기술은 뇌실에 한정되지 않는다; 그것은 다른 뇌 심실에서 섬모를 관찰하는 데에 이용 될 수있다. 이 영상 기술은 생체 외 환경에서 섬모의 박동에 의해 뇌척수액의 움직임과 유사한 라이브 스트림을 제공한다. 또한, 섬모의 운동 ?...

섬모 세포 외 환경으로 세포 표면으로부터 연장 감각 미세 소관 기반 소기관이다. &quot;9 + 0&quot;또는 &quot;9 + 2&quot;- 미세 소관들은 조직에 따라 섬모는 두 가지 유형으로 분류 될 수있다. 기능적으로, 그들의 운동에 기초하여, 이러한 운동성 또는 비 - 운동성 섬모 1로 분류 될 수있다. 차 섬모는 일반적으로 &quot;9 + 0&quot;비 운동성 섬모를 나타 내기 위해 사용되는 용어입니다. 이들은 ( &#39;9&#39;로 표시) 아홉 평행 겹 미세 소관 있고 미세 소관의 중앙 쌍 ( &#39;0&#39;로 표시) 내에서 중앙 피복 부재. 그러나, 배아 편측성 규제 등 절점 섬모 일부 &quot;9 + 0&quot;섬모는 2 운동성이다. 한편, 운동성 섬모는 미세 소관 이중선의 추가적인 중앙 쌍, 아홉 병렬 미세 소관 이중선에 더하여, 특징 및 운동성을 촉진하기 네인 모터 단백질과 연관된. 또한, 일부 &quot;9이러한 후각 섬모 등이 &quot;섬모 3 비 운동성이 있습니다. 뇌 심실 및 척수의 중심 관을 긋고 뇌실막 세포는 뇌 심실 4 따라 뇌척수액 (CSF)를 추진 운동성 섬모 특징으로한다. 이 방법의 전반적인 목표는 섬모 역학과 구조적 이상 운동성 연구를 촉진하는 것입니다. 뇌의 건강과 발전은 크게 뇌의 뇌실 내 뇌척수액의 효율적인 순환에 따라 달라집니다. 예를 들어, 정상 뇌척수액의 흐름과 유체 균형은 정상 박동 차례로 신경 세포의 방향 움직임을 조절하는 중요한 역할을하고 세포 이동 (7) 줄기 기능 뇌실막 섬모 5,6 필요합니다. 이러한 비정상적인 뇌실막 섬모 기능 또는 뇌수종과 연관된 비정상적인 CSF 흐름을 초래할 수 구조체로서, 용태가있는 (B)의 심실에서 CSF의 비정상 축적이 존재비. 이것은 결과적으로 두개 내 압력과 머리, 경련, 터널 비전의 점진적 확대, 정신 장애 (8) 증가의 원인이 될 수 있습니다. 기존의 방법에 비해이 기술의 장점은 세 가지 뇌실막 세포 유형을보고 처음 허용한다는 것이다 : I, 고유 모양체 비팅 주파수 및 각도 박동에 근거 II 및 III. 이 뇌실막 세포는 뇌의 뇌실에 특정 지역 내에서 지역화됩니다. 또한, 나이 등과 같은 알코올 및 뇌실막 세포 유형 또는 지역화 변경에 실로 스타 졸과 같은 약리학 적 제제의 효과는 뇌실막 세포의 분류 이전에는 불가능이었다 증명 될 수있다. 실로 스타 졸은 포스-3 저해제, AMP에 캠프 대사 효소이며 세포 내 칼슘도 9를 조절한다. 고속 형광 영상 분석을 이용하여 세포 내 고유의 이미징 및 정량을 허용뇌실막 세포의 칼슘 진동 특성. 예를 들면, 실로 스타 졸 및 알콜 모두 크게 차례로, 뇌실막 섬모 10 의해 뇌척수액 볼륨 여분의 변화로 이어질 수 뇌실막 모양체 비팅 주파수뿐만 아니라, 세포 내 칼슘의 진동 특성을 변경. 요약하면,이 기술은 다른 칼슘 발진 특성 뇌실막 세포의 세 가지 유형 중 첫번째 증거를 제공하는 핵심이다. 다음 섹션에서, 절차의 상세한 단계별 개요는 티슈 제조 및 취급에 세심한주의를 기울이고, 제공된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Multiciliated 뇌실막 세포는 성인의 뇌에 심실 라인. 이상 기능이나 뇌실막 섬모의 구조는 다양한 신경 학적 결손과 관련이있다. 운동성 섬모 뇌실막 기술의 생체 라이브 영상 전류는 여러 단계를 다음과 섬모의 역학에 대한 자세한 연구를 위해 수 있습니다. 이 단계는 다음과 같습니다 마우스 이산화탄소와 안락사를 톨레도의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 프로토콜에 따라; vibratome 또는 날카로운 블레이드와 뇌 제거 및 시상 뇌 해부 다음에 두개 절제술은 뇌실막 섬모가 가시화 될 수있는 뇌 측면 심실을 통해 매우 얇은 섹션을 얻었다. 95 % / 5 % O의 존재하에 2 / CO 2 혼합물을 37 ℃에서 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) / 하이 글루코스를 함유하는 맞춤형 유리 - 바닥 접시 뇌 슬라이스 포란 살아있는 조직을 유지하는 것이 필수적이다 시실험. 섬모 고해 비디오이어서 고해상도 미분 간섭 현미경을 이용하여 기록된다. 비디오는 섬모 비팅 주파수를 계산하는 프레임 단위로 분석한다. 이것은 그들의 섬모 박동 주파수와 각도에 따라 세 종류 또는 유형에 뇌실막 세포의 뚜​​렷한 구분을 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 뇌실막 세포 특유의 세포 내 칼슘 발진 특성뿐만 아니라, 칼슘 진동에 약리학 적 제제의 효과 및 모양체 비팅 주파수의 특성을 고속 형광 영상 분석의 사용을 허용한다. 또한,이 기술은 섬모 구조 및 섬모 단백질 지역화 연구 면역 촬상에 적합하다. 이는 질병 진단 및 표현형 연구에서 특히 중요하다. 뇌 조직이 죽는 시작으로 기술의 주요 제한은 라이브 운동성 섬모 운동의 감소에 기인한다.

라이브 마우스의 뇌에 뇌실막 섬모 기능을 측정 이 프로토콜에 기재된 방법은 마우스 뇌뿐만 아니라 모니터링 섬모 비팅 주파수 공부 해부 신선한 조직 뇌실막 섬모 기능과 구조를 모니터링하는 데 사용된다. 전체 실험을 수행하기 위해 그 다음 단계는 개략 플로우 차트 (도 1)에 도시된다. 이것은 고도로 실험 가능한 활성 운동성 섬모를 유지하기 위해 짧은 시?...

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Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K 조회수.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다. 

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Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

연구

신경과학

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

Zebrafish 배아 뇌 심실의 수동 배수

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this challenging. Because the ventricles are negative spaces located deep within the brain, the only way to understand their anatomy is by appreciating their boundaries formed by related structures. Looking at a 2D representation of these spaces, in any of the cardinal planes, will not enable visualisation of all of the structures that form the boundaries of the ventricles. Thus, using 2D sections alone requires students to compute their own mental image of the 3D ventricular spaces. The aim of this study was to develop a reproducible method for dissecting the human brain to create an educational resource to enhance student understanding of the intricate relationships between the ventricles and periventricular structures. To achieve this, we created a video resource that features a step-by-step guide using a fiber dissection method to reveal the lateral and third ventricles together with the closely related limbic system and basal ganglia structures. One of the advantages of this method is that it enables delineation of the white matter tracts that are difficult to distinguish using other dissection techniques. This video is accompanied by a written protocol that provides a systematic description of the process to aid in the reproduction of the brain dissection. This package offers a valuable anatomy teaching resource for educators and students alike. By following these instructions educators can create teaching resources and students can be guided to produce their own brain dissection as a hands-on practical activity. We recommend that this video guide be incorporated into neuroanatomy teaching to enhance student understanding of the morphology and clinical relevance of the ventricles.

This paper demonstrates the effective use of a fiber dissection method to reveal the superficial white matter tracts and periventricular structures of the human brain, in three-dimensional space, to aid student comprehension of ventricular morphology.

깊은 공간-인간 두뇌의 측면 심 공개 뇌 구조 해부학 적 탐구

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.