Name: in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.

1 원유 영속 페로몬 생산 <ol><li> OP50 E. 성장 하나의 식민지 O에서 / N 37 ° C에서 대장균은 200 rpm에서 LB 배지 100 ㎖에 떨고있다. 참고 :이 O / N 문화가 사전에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> N2 C. 성장 엘레 15 - 20 OP50 E.의 50 μL 시드 NGM 한천 (표 1의 레시피 참조) 6cm 배양 접시 대장균 박테리아까지 거의 19 고갈된다. </li><li> 1 L 삼각에 S 미디어의 5 배 250 ㎖에 (표 1의 레시피를 참조하십시오) 확인은 19 플라스크. 참고 :이 솔루션은 사전에 할 수있다. </li><li> OP50 E.의 문화를 성장 E.에서 OP50의 1 ㎖로 접종하여 LB 국물 O의 4 L / N에서 대장균 대장균 및 16 시간 동안 37 ° C에서 떨고. </li><li> (S 기저 용액 (표 1의 제조법 참조) 및 단계 1.3에서 제조 된 S 미디어 4 일 L 삼각 플라스크 각각에 4 ~ 5 판에서 전송 선충 1 ㎖와 함께 접시 (단계 1.2)에서 4를 선충을 씻으 5 판각 실린더 용) 19. </li><li> 10 분 동안 650 XG에서 단계 1.4에서 OP50을 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. S 기저 용액 10 ㎖ 중의 각 세균 펠렛을 재현 탁. 선충의 각 플라스크에 재 부유 세균의 같은 양을 전송합니다. </li><li> 이 솔루션은 음식의 고갈을 나타내는 취소 시작할 때까지 5 일 - (- 25 ° C에서 20) 100 - 4 150 rpm으로 실온에서 진탕에 플라스크를 배치합니다. </li><li> 음식이 고갈되면, OP50 E.의 또 다른 O / N 문화를 성장 LB 국물의 4 배 1 L에 대장균. 10 분 동안 650 XG에서 박테리아를 원심 분리기 및 선충류와 S 미디어 플라스크에 각각 한 플라스크에서 펠렛을 추가합니다. 음식이 다시 소진 될 때까지 추가 3~4일를 들어, 단계 1.7에서와 같이 진탕에 S 미디어 플라스크를 돌려줍니다. </li><li> 각 플라스크 용액의 ~ 1 ㎖의 분취 량을 가지고 각 1 ㎖의 분취에서 1 μl를 서브가 샘플링 및 선충의 수를 계산하여 선충의 농도를 추정한다. 참고 :75,000 선충 / ㎖ - 선충 인구는 50,000 있어야합니다. 이 농도에서 선충 대부분 dauers이다. </li><li> 오염 된 플라스크를 폐기하십시오. 참고 : 오염 자주 단계 1.9 동안 본 곰팡이 균사로 나타난다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기 선충. 선충 펠렛을 버리고 상층 액을 유지합니다. 대안 적으로, 낮은 - 역가 페로몬을 만들기 위해 동물을 사용하여 이들에 대한 설명을 참조. </li><li> # 1 와트 만 여과지를 통해 뜨는을 필터링합니다. 주 : 진공 플라스크에이 과정을 촉진 할 것이다. </li><li> 또한 0.45 μm의 멸균 진공 여과 장치를 통해 뜨는을 필터링 할 수 있습니다. 참고 : 여과 액은 4 ° C에서 O / N을 유지 또는 1.14로 진행 할 수 있습니다. </li><li> 교반 막대와 2 L 비이커에 여과 액을 추가합니다. 가열 볶음 접시에 흄 후드에 배치합니다. 교반하면서 끓기 약 200 ㎖의 증발. 500 ㎖의 비이커에 용액을 전송. 약 50 ㎖를 제작 때까지 끓는 계속피트 NOTE : 용액 위에 비등하는 것이 가능한 한 용품은이 단계에서 수행되어야한다. 50 ml의 최종의 색은 어두운 갈색이다. 조리 과정 중에 언제든지 열이 해제 될 수 있고, 여과 액을 RT 또는 4 ℃에서 O / N을 기억. </li><li> g 차가운하자 X 1000에서 5 분 동안 원심 분리. 100 ㎖의 비이커에 뜨는을 붓고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 갈색 빵 껍질에 뜨는을 졸이다. 열에서 제거하고 주걱 지각을 휴식. 지각을 커버하기에 충분한 200 증거 에탄올을 추가합니다. 파라 필름으로 비이커를 커버하고 RT에서 O / N 앉아 보자. 깨끗한 비커에 에탄올을 붓고 옆에 넣어. 지각을 커버하는 신선한 에탄올을 추가합니다. O / N의 추출을 3 회 반복합니다. 추출물을 풀입니다. </li><li> 에탄올 추출물을 건조 진공 펌프를 사용합니다. 진공 펌프를 사용할 수없는 경우 흄 후드에서 교반하면서, 50 ° C로 깨끗한 비커에 따뜻한로 에탄올 추출물을 추가합니다. 참고 : 에탄올 리터의 끈끈한 잔류 물을 증발되면광명 브라운 컬러는 유지되어야합니다. 가열이 사용되는 경우,주의가 너무 오랫동안 가열하여 용액을 구울주의해야한다. </li><li> 멸균 증류수 10ml에 잔류 물을 용해. 필터는 1 ㎖의 분액에서 -20 ° C에서 0.22 μm의 주사기 필터 및 저장이 솔루션을 소독. 참고 : 물 1 ㎖의 원액 선충 문화의 100 ML에 대한 잔류 물을 용해하는 데 사용됩니다. 액체 배양 플라스크 중 하나는 오염으로 인해 폐기되는 경우, 예를 들어, 다음, 잔사를 용해하는 데 사용되는 물의 양을 조절한다. </li></ol> 페로몬 복용량 응답의 2 결정 <ol><li> 펩톤없이 노블 한천로 NGM 미디어의 6 배 5 mL를하여 영속 페로몬을 준비하고, 50 / ㎖ 스트렙토 마이신, 황산 μg과 영속 페로몬의 범위와 보충. 4, 19 (표 1에서 제조법 참조) 13x100 mm의 구성 요소를 믹스 유리 문화 튜브, 분젠 버너를 통해 종기, 다음 3cm 페트리 접시에 붓는다. </li><li> 오전의 무게를icrocentrifuge 관. E.의 O / N 문화의 한 ML을 추가 microcentrifuge 관에서 ~ 17,000 XG에 튜브와 원심 분리기에 대장균 OP50. 상층 액을 모두 제거합니다. 다시 튜브를 달아 세균 펠릿의 중량을 결정한다. 4 %의 최종 농도를 위해 M9 완충액 (표 1의 레시피를 참조) 펠렛을 재현 탁 (/ w v). 나누어지는 각 페로몬 판 (4)의 중심 상에 세균 현탁액 10 μL. 저장 판 O / RT에서 N. </li><li> 페로몬 판 (4) 상에 성인으로 탈피 한 후 10 ~ 15 임신하는 N2 야생 형 자웅 동체에게 일일를 선택합니다. 4 시간 - 3 25 ° C에서 번호판을 저장합니다. </li><li> 성인 자웅 동체의 모든를 선택합니다. 각 접시에 누워 계란의 수를 기록한다. 파라 필름과 판을 밀봉하고 삼일 (17)에 대해 25 ° C로 돌아갑니다. </li><li> dauers의 비율을 계산한다 (그림 2). 참고 : 두 가지 방법의 경우는주의하는 것이 중요하다 dauers (그리고에 낮은 전십t 비 dauers)의 벽을 오르고, 페트리 접시의 뚜껑 위에 것이다. 이 선충에 대한 요리의 모든 표면을 검사하는 것이 중요하다. </li><li> 용량 - 반응 곡선의 데이터를 장착하고도 3에 도시 된 바와 같이 (dauers을 형성하기 위해 동물의 90 %를 유도하기에 충분한 페로몬) 페로몬의 EC (90)의 농도를 추정 참고. 우리는 보통 EC (90)을 추정하기 위해 로지스틱 회귀 모델을 사용 하지만 서로 다른 통계 소프트웨어 패키지는 유사한 추정치를 생산하는 다른 방법이있을 수 있습니다. </li></ol> 영속 IL2 뉴런의 3 라이브 영상 <ol><li> 단계 2.6에서 결정된 EC 90 값을 사용하여 프로토콜이 같이 영속 페로몬 판을 준비합니다. </li><li> 통합 IL2 리포터 유전자를 운반하는 균주 (myIs13 [P의 KLP-6 :: GFP] myIs14 [P의 KLP-6 :: GFP] myIs16 [P와 프로토콜이있는 방법을 사용하여 dauers을 유도 <em&gt; KLP-6 :: tdTomato] 또는 qIs56 [P 지연-2 :: GFP]) 12, 20, 21 참고 :. Q Is56를 사용하는 경우, GFP의 발현에 몇 시간까지 IL2Qs에 표시되지 않습니다 영속 탈피하고 초기 리모델링 이벤트 중 일부는 표시되지 않습니다. P 래그-2 : GFP 유전자에서 형광 신호가 P의 KLP-6 형광 리포터보다 영속 동안 IL2s 궁극적 밝게하면서 또한,이 P 래그-2 : GFP 유전자는 머리 근육에 약하게 발현되는 미세 IL2 분기에 마스크를 적용 할 수 있습니다. </li><li> 달걀 누워 다음, 성인 자웅 동체를 제거 파라 필름과 번호판을 봉인하고 25 ° C 17에서 34 시간 동안 배양한다. 참고 : 영속 탈피에 시간의 길이는 개인 사이에서 약간 다릅니다. 영속 탈피의 시작 5 시간 (39 - - 수상 돌기 arborization의 가장 빠른 기간은 4를 시작합니다 (44)시간 포스트 달걀 누워 25 ° C) 12시. </li><li> 촬영 전날, EC 90 농도의 영속 페로몬과 M9 버퍼에 10 %의 용액 (w / v)의 아가로 오스를 구성합니다. 나누어지는 아가로 오스의 약 100 μl의 현미경 슬라이드 상에 신속하게, 조심스럽게, 평면 아가로 오스 표면을 만들기 위해 상단에 다른 슬라이드를 배치합니다. 아가로 오스가 고형화 후, 습도 챔버 (젖은 종이 타월로 피펫 팁 상자)에 사란 랩 및 저장소에 슬라이드를 래핑합니다. </li><li> 34 시간의 잠복기 후, 인두 펌핑을 중지 선충에 대한 페로몬 판을 검사합니다. 개별 슬라이드 한 슬라이드 일면에만 그것에 아가 갖도록. 10 % 아가로 오스 패드와 0.1 미크론 폴리스티렌 비즈 22의 한 μ 리터에 하나 이상의 선충을 선택합니다. 참고 : 잘 동기화 인구, 접시에 선충의 대부분은 L2D에서 영속에 털갈이로 입력됩니다. 그러나, 나는 사이에서 변동이있을 수 있습니다ndividuals. 그것은 동물이 영속 탈피 내왔다 시간 (예를 들어 대표적인 결과 참조)의 양을 추정하기 위해 추가 기능 (인공 항문 폐쇄, 인두 리모델링)을주의하는 것이 중요합니다. </li><li> 선충의 방향을 (좌 / 우, 지느러미 / 복부)를 결정합니다. 가능한 최저 형광 강도와 100X 배율 매 15 분으로 IL2Q 덴 드라이트의 Z-스택 이미지를 캡처하거나 특정 실험에 필요한. (인두가 펌핑 시작) 선충은 L2D 표피에서 분리 될 때까지 캡처 이미지를 계속 동물이 영속을 복구하는 경우 고정이 불가능하거나. 적극적 묘화하지 않을 때, 습도 챔버에 슬라이드를 배치했다. 참고 : 우리는 전동 무대와 미분 간섭 대비 (DIC) 광학과 epifluorescent 현미경을 사용합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

영속 별 신경 가소성 및 기타 영속 관련 형태 학적 변화를 검사 통제되고 하나 유전자 변이 (즉, DAF-C 돌연변이)를 통해 또는 페로몬 야생 형 동물의 노출에 의해 dauers의 안정적인 형성이 필요합니다. dauers를 유도하는 유전자 변이의 사용이 편리하지만, 그 결과를 혼란시킬 수있다. 따라서 DAF-C 돌연변이로 수집 된 데이터는 이후 영속 페로몬에 노출 영속 단계를 입력하도록 유도 야생?...

발달 및 행동 가소성을 포함 표현형 소성은 불리한 환경 조건에 적응하기위한 중요하고 진화 한 원동력으로 간주됩니다. C. 엘레 자주 개발 및 신경 생물학의 연구에 사용되는 모델 생물이다. 이상적인 조건에서, C. 엘레 성인 생식 단계에 들어가기 전에 사 애벌레 단계를 통해 개발하고 있습니다. 그러나, 낮은 음식 가용성과 높은 인구 밀도, C의 조건에서 엘레 발달 스위치를 받아야하고 수명이 긴 스트레스에 강한 영속 2 단계로 입력 할 수 있습니다. Dauers 가능성이 스트레스 저항을 중재 비 dauers에서 여러 형태 학적 및 행동의 차이를 표시합니다. 영속 항목을 규제하는 환경 단서 및 유전 적 경로가 광범위하고, 5, 4, 3 6, 7을 설명했다. 그러나, 각각의 표현형의 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 거라고 발생하는uring의 영속 형성이 덜 잘 이해된다. 영속 특정 표현형 검사는 영속 동물의 생산을 필요로한다. 이 세 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다 : 1) C의 결핍 문화 따기 엘레 간스, 2) 영속 형성 제정 (DAF-C) 돌연변이, 정제 페로몬을 통해 영속 형성 3) 유도의 사용. 그것은 C.있는 표준 NGM 플레이트에서 dauers을 선택하는 비교적 간단하다 그 박테리아의 식품 공급을 소진했다 elegans의 인구. 우리의 손으로, 표준 NGM 플레이트는 원래 삼일 성장이 허용 이후 3 접종 OP50 대장균의 50 μL, 시드 - 4 성인 자웅 동체는 일주 내에서 식량 공급을 배출하고 수천을 생산합니다 25 ° C로 유지 추가 3 일 이내 dauers (공복 수많은 비 dauers 이외에). 그러나,이 방법은 D로 탈피 중에 발생하는 검사 공정에 불만족AUER. 그것은 영속에 입력하는 일반적인 굶주린 접시에 수천의 동물을 결정하기가 어렵습니다. 또한, 고갈 플레이트의 사용은 동기화를위한 가능성을 제공하지 않는다. DAF-C 돌연변이 체의 사용은 동기화 및 dauers의 안정적인 생성을 허용한다. 그러나, 특정 DAF-C 돌연변이가 단독으로 또는 추가 돌연변이와 함께 다른 영속 특정 표현형에 영향을 미치지 않는다는 보장은 없습니다. 영속 페로몬의 존재는 첫째 Cassada 러셀에 의해 암시하고 나중에 황금과 수수께끼에 의해 입증되었다. 영속 페로몬은 이후 화학적, 열 9, 8,이 특징으로하고있다. 정제 된 페로몬은 다른 형태로 9, 원유 영속 페로몬 추출물 11. 사용이 가능 모두 행동 및 발달 과정을 조절 ascarosides의 복잡한 혼합으로 구성 야생형 백그라운드에서 동기화 dauers의 안정적인 제어 유도. </p&gt; 신경계 및 관련 아교 세포는 영속 유충 형성 12, 13, 14시 개장을받을. 이러한 변화 중 일부는 영속 13 일 14시 신경교 세포의 리모델링으로 되돌릴 수 있습니다. 그러나 다른 리모델링 이벤트가 유리한에 반환시 되돌릴 수 있습니다 환경 조건에 따른 것입니다. 수상 돌기 arborization, multidendritic 신경 세포와 축삭이 12 개조에 하나의 돌기에서 스위치 : 예를 들어, 네 IL2Q 뉴런의 집합을 포함 영속 형성하는 동안 신속하고 가역적 신경 리모델링을 거쳐. 방법은 여기에 모델 생물 스트레스에 의한 신경 가소성의 신뢰할 수있는 생체 내 이미징 할 수 있습니다. 원유 생산 및 영속 페로몬의 테스트를 위해 제시된 방법은 앞서 여러 소스 4, 8, 15, 16, 17, 18에서 설명한 컴파일된다.

<table><tbody><tr><td>N2 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Bristol strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] III</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 myIs14[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868 qIs56[P&lt;sub&gt;lag-2&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O autoclaved cooled to 55&amp;deg;C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>S Media</td><td>Various</td><td></td><td>S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.5 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate&lt;sub&gt;, &lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g MnCl2&amp;bull;4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.29 g ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.025 g CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, and 0.75 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>Dauer pheromone plates for dose-response assay</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 &amp;micro;l of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to bring the volume to 4.725 ml.&amp;nbsp; Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 &amp;deg;C. Add 125 &amp;micro;l 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 50 &amp;micro;l 0.1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 50 &amp;micro;l 0.1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 50 &amp;micro;l of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.&amp;nbsp; Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).</td></tr><tr><td>Microsphere beads 0.1 micron</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans

동물의 스트레스에 의한 표현형의 가소성을 조절 메커니즘은 생체 내에서 공부를 자주 복잡하고 어렵습니다. 스트레스에 의한 소성의 전형적인 예는 C의 영속 무대 엘레 간스. Dauers 박테리아 음식과 영속 페로몬의 높은 농도의 낮은 농도의 조건에서 형성된 대안 발달 애벌레 단계이다. Dauers 광범위한 발달 및 행동 가소성을 표시합니다. 예를 들어, 네 개의 내부 - 순측 사분면의 세트 (IL2Q) 뉴런 영속 형성 동안 광범위한 가역 리모델링을 겪는다. 대형 선충 액체 배양에서 원유 영속 페로몬의 생산을위한 잘 알려진 경로 환경을 미치는 영속 항목, 이전에 설정된 방법을 활용하는 것이 입증된다. 이 방법으로, 50000의 농도 - 배양액 75000 선충 / ㎖가 고도로 강력한 원유 영속 페로몬을 생산하기에 충분하다. 조 페로몬의 효능 dete입니다용량 반응 생물 검정법에 의해 rmined. 마지막으로, 영속 형성하는 동안 IL2Qs의 생체 시간 경과 영상에 사용되는 방법이 설명되어 있습니다.

더위와 추위 안정적인있는 노란색 액체의 원유 영속 페로몬 결과 (그림 1)의 생산. 원유 페로몬 일정량 활동의 명백한 손실 무기한 -20 ° C에 저장됩니다. 페로몬의 제조에 이어, 단일 용량 - 반응 생물 검정법의 효능은 대략적으로 충분하다. 3 회, 각 실험으로부터 평균을 취 - 그러나, 대부분의 실험에는 생물 검정 2를 반복 할 필요가있다. 이 페로몬 생물 검정에서 대표 결과는 그...

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In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

11.2K 조회수.  University of Illinois Urbana-Champaign. Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer. 

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

연구

생체공학

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

생화학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

신경과학

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

생물학

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million people worldwide. Since many details about PD etiology remain unknown, studies investigating genetic and environmental contributors to PD are needed to discover methods of prevention, management, and treatment. Proper characterization of dopaminergic neuronal loss may be relevant not only to PD research, but to other increasingly prevalent neurodegenerative disorders.
There are established genetic and chemical models of dopaminergic neurodegeneration in the Caenorhabditis elegans model system, with easy visualization of neurobiology supported by the nematodes&#39; transparency and invariant neuronal architecture. In particular, hermaphroditic C. elegans&#39; dopaminergic neuron morphological changes can be visualized using strains with fluorescent reporters driven by cell-specific promotors such as the dat-1 dopamine transporter gene, which is expressed exclusively in their eight dopaminergic neurons.
With the capabilities of this model system and the appropriate technology, many laboratories have studied dopaminergic neurodegeneration. However, there is little consistency in the way the data is analyzed and much of the present literature uses binary scoring analyses that capture the presence of degeneration but not the full details of the progression of neuron loss. Here, we introduce a universal scoring system to assess morphological changes and degeneration in C. elegans&#39; cephalic neuron dendrites. This seven-point scale allows for analysis across a full range of dendrite morphology, ranging from healthy neurons to complete dendrite loss, and considering morphological details including kinks, branching, blebs, and breaks. With this scoring system, researchers can quantify subtle age-related changes as well as more dramatic chemical-induced changes. Finally, we provide a practice set of images with commentary that can be used to train, calibrate, and assess the scoring consistency of researchers new to this method. This should improve within- and between- laboratory consistency, increasing rigor and reproducibility.

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

In this article, we showcase how to use a seven-point scoring system to consistently quantify changes to dopaminergic neuron dendrite morphology in C. elegans. This system is intended for analyses of dopaminergic neurodegeneration assays utilizing genetic, chemical, and age-based models of neurodegenerative disorders.

Caenorhabditis elegans에서 도파민인체학 뉴런 형태 학적 변경 및 변성의 수준을 정량화

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

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생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징