Hammarlund 실험실 작업에 의해 후원됩니다 NIH R01 부여 NS066082 - 01과 T32GM007223, 베크맨 재단, 그리고 엘리슨 의료 재단.

1. 시스템을 조립 시스템의 특정 구성 요소는 다음과 같습니다. 제대로 조립하면, 사용자가 한 손으로 현미경을 집중할 수 있어야합니다, (중 마우 스나 조이스틱과 함께) 다른과 함께 무대를 이동 발 페달로 레이저를 활성화하고, 온 -을 확연히 볼 수있다 화면 이미지. <ol><li> MicroPoint 레이저 복합 현미경의 에피 형광 포트를 탑재. 우리는 니콘 80i를 사용하지만, 모든 연구 수준의 직립하거나 거꾸로 범위는 작동합니다. MicroPoint 시스템은 절단하고자하는 세포 라벨 형광단과 일치해야합니다 사용자 정의 이색성를 포함합니다. 대안 fluorophores와 라벨 커팅 세포가 추가 dichroics이 필요합니다. 또한, 펄스 발생기 및 발 페달은 MicroPoint 시스템을 함께. </li><li> 100x, 1.4 NA 오일 수술을 수행하고 중생을 평가하기위한 목적뿐 아니라 슬라이드에 샘플을 위치에 필요한 추가적인 목표. 우리는 수술 니콘 계획 APO VC를 사용하여 4X가 거친 초점 샘플을 찾는 데 유용합니다 것을 발견했습니다. </li><li> 조이스틱과 함께 무대를 동력. 무대에만 타겟팅에 사용되기 때문에 매우 높은 정확성과 repeatability있는 무대가 필요합니다. 우리는 전에 OptiScan II를 (토론 참조)을 사용합니다. </li><li> 카메라. 카메라는 컴퓨터 모니터에 이미지를 떠올리면서, 초점과 100x 목적으로 표시된 neurite를 대상으로 충분한 프레임 속도를 제공해야합니다. 우리는 (아래 1.7 참조​​) 사진 표백 또는 손상의 가능성이 혼란함을 주죠 효과를 피하기 위해 axotomy 절차 동안 조명 광을 attenuating 선호합니다. 따라서, 카메라는이 빛을 감소 수준을 수용할 정도로 민감한해야합니다. 우리는 하마 마츠 오카 05G를 사용하고 16.3 Hz에서에서 이미지가 충분합니다 찾습니다. 상응하는 카메라가 대체 수 있습니다. </li><li> 카메라를 운전할 수 컴퓨터, 모니터, 및 이미징 소프트웨어. 또한, 우리는 (토론 참조) 마우스 전동 무대를 조작하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 에어 테이블. 이 요구 사항은 지역에 따라 달라질 수 있지만 수술이 100x 목적으로 수행되기 때문에, 우리는 진동 절연은 필수적으로 찾습니다. </li><li> 조명 가이드 및 형광단을 계몽을위한 셔터 메커니즘과 라이트 공급. 조명 가이드 MicroPoint에 연결합니다. 셔터 메커니즘은 독립적으로 레이저의 조명 강도를 줄이는 데 유용합니다. 우리는 이전 루멘 200 Leica EL6000를 사용하여 axotomy에 대한 전체 빛의 강도의 80 %까지 감쇠. </li></ol> 2. 레이저 설정 초기 정렬 및 레이저를 초점 자세한 프로토콜은 MicroPoint 레이저 시스템으로 제공됩니다. 우리는 그 절차가 초기 설정에 따라 성공적으로 뒤를되었습니다 가정합니다. 이것은 접안 렌즈의 주목을 가진 레이저를 정렬이 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 레이저의 초점과 강도의 정기적인 유지 보수를위한 프로토콜을 제공합니다. 로 MicroPoint 설명서에 명시된 바와 같이, 펄스 질소 레이저는 심각하게 인간의 눈을 손상시킬 수 있습니다. 치료는 레이저 빔을 직접 쳐다보지도 않을로 이동해야합니다. 일단 설치 장벽 필터 안전하게 eyepieces를 통해 방사선을 차단해야합니다. 유기체의 신경을 절단의 모래알의 크기는 도전하실 수 있습니다. 레이저에 의해 수행 피해 면적이 아주 작은이기 때문에 그것은 정확하게 샘플을 대상으로 위해 레이저의 초점의 3 차원 위치를 알고하는 것이 필수적입니다. 레이저 초점은 미러 슬라이드를 사용하여 발견된다. 첫째, 우리는 레이저 초점의 Z 위치는 이미지 경로의 초점과 일치하는지 확인하십시오. 다음 피해 초점의 XY 위치는 이미징 소프트웨어의 주목과 함께 표시됩니다. Z - 비행기에 초점 <ol><li> 중립 밀도 필터 ND16 (그림 1A)에서 누르십시오. 우리는 집중하는 동안 레이저를 자제하는 에피 조명 경로에 중립 밀도 필터를 사용합니다. 에도 미세한 초점을 맞추고, ND16 및 ND4 형광 필터 모두에 밀어. </li><li> 스위치 1 펄스에 MicroPoint 레이저를 세트 &#39;선택&#39;(그림 1B), 그리고 적절한 긴 도로 장벽 필터 (그림 1C)에 필터 휠을 이동으로 변하고있는 상황입니다. </li><li> 무대에서 미러 슬라이드를 삽입하고 전달 빛을 사용하여 4X 목적으로 그 안에서 pinholes에 중점을두고 있습니다. </li><li> 미러 슬라이드 침지 기름 한 방울을 추가하고 100X 목적으로 pinholes에 집중할. 레버 (그림 1D)와 레이저 셔터 (그림 1E)을 전환 광학 경로로 카메라 셔터를 엽니다. 필요한 경우 pinholes의 가장자리가 선명하므로, 전송 빛의 강도를 감소 : 이것은 정확하게 초점에 도움이됩니다. </li><li> 발 페달을 누르십시오. 레이저가 제대로 초점을 맞추고있다면 이것은 거울에 작은 구멍을 생산해야합니다. </li><li> 약간 미러 슬라이드의 비행기 위에 현미경을 집중하고 다시 레이저를 쏴. 이것은 심지어 작은해야첫 번째 총알보다 구멍, 또는 전혀 흔적을 남겨 두지 않습니다. 미러 슬라이드 아래에 초점을 맞춤으로써 반복합니다. </li><li> 구멍이 2.5에서 생산되지 않은 경우, 또는 거울의 표면 위 또는 아래 초점을 때 큰 구멍이 생산하는 경우, 절제 머리에 초점 링과 함께 레이저를 집중할. 구멍이 여전히 제대로 접안 렌즈의 주목에 부합되는지 확인합니다. 일관성 사용, Z - 비행기의 초점은 거의 조정할 필요가 없다. </li></ol> XY 평면의 중심 <ol start="8"><li> 위의 2.3을 통해 2.1 단계를 수행하여 미러 슬라이드에 작은 구멍을 만들기 위해 발 페달을 누르십시오. </li><li> 시작 메뉴 요소 &#39;수집&#39;에서 모드를 캡처 &#39;를 라이브. &#39;측정&#39;툴바 선택 &#39;투자 수익 (ROI) 편집기&#39;에서 다음 &#39;더블 십자가&#39;도구를 선택하고 새로운 구멍의 중앙에 그들을 정렬하기 위해 주목을 끕니다. 그리고 &#39;종료 편집기&#39;은 투자 수익 (ROI) 저장 &#39;을하고 라이브 캡처 모드를 다시 클릭합니다. </li><li> 마우스로 무대를 조작 요소의 &#39;마우스 XY&#39;설정을 활성화합니다. </li><li> , 다시 원래 위치 (S)에 대한 중립적인 밀도 필터를 당겨 10 레이저 펄스를 설정하고, 미러 슬라이드를 제거합니다. </li></ol> 레이저의 전원을 조정 <ol start="12"><li> 레이저의 능력은 선택의 신경 세포를 잘라하는 데 필요한 최소 전력으로 조정해야합니다. 생활 웜 (아래 설명) 깎다 감쇠기 판 (그림 1 층)을 이동하여 전력을 조정합니다. 레이저 전원이 너무 높으면, 그것은 주변 손상 시키거나 벌레 구멍을 폭발합니다. 레이저 전원이 너무 낮으면, 그것은 신경을 도려하지 않습니다. 시스템이 설치되면, 감쇠기 위치는 거의 변경할 필요가 없다. 레이저 약한되고, 감쇠기 플레이트가 절단 계속 이동해야하는 경우, 그것은 염색 세포에 염색이 (토론 참조) 교체해야한다는 서명 수 있습니다. </li></ol> 3. 벌레를 고정 <ol><li> 3퍼센트 M9의 용융 아가로 오스 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 85mM NaCl, 1mM MgSO4)의 솔루션을 준비합니다. 15 ML 팔콘 튜브로 용융 아가로 오스의 5 ML 하는걸. 다른 튜브 물을 채우십시오. 모듈형 가열 요소에 장소 튜브 55 ° C. 설정 각 튜브 미니 물 목욕을 만들 물로 가열 요소를 채웁니다. 참고 : 아가로 오스는 미리 대량으로 준비하고 후속 실험에 다시 녹아 수 있습니다. </li><li> 이 슬라이드의 각 이러한 슬라이드 사이에 깨끗한 슬라이드에 라벨 테이프 두 레이어를 놓습니다. 깨끗한 슬라이드 및 그 결과 아가로 오스 패드 테이프 두 조각 (그림 2)의 두께가되도록 첫 번째 장소 다른 슬라이드 직각을 중간에 플라스틱 전구의 피펫을 사용하여 아가로 오스의 드롭을 분배. 30초 후 패드에서 두 슬라이드 중 하나를 제거합니다. 린스 이후 슬라이드와 함께 사용하기 위해 물 채워진 팔콘 튜브의 플라스틱 피펫을 저장합니다. </li><li> 다음 장소 패드의 중앙에 0.10 μm의 또는 0.05 μm의의 폴리스티렌 구슬 3-5 μL. 관심의 뉴런에 형광 단백질을 표현 50-10 벌레를 추가합니다. 관심의 뉴런이 불균형 웜의 오른쪽이나 왼쪽에 배포하는 경우, 올바른 측면가 직면되도록 벌레를 돌려 플래티넘 선택을 사용합니다. 웜는 아가로 오스 패드 준비 10 분 이내에 슬라이드에 삽입되어야합니다. </li><li> 조심스럽게 벌레에 커버 전표를 놓습니다. 커버 슬립을 배치하면, 이것은 표피를 방해하고 벌레를 파괴하므로 아가로 오스 패드로 상대 이동하지 않습니다. 현미경 단계에 준비된 슬라이드를 놓습니다. </li></ol> 4. 컷 뉴런 <ol><li> 광학 경로 스위칭 레버와 eyepieces에 직접 빛을. 4X 목적으로 절단하는 벌레에 초점, 커버 슬립에 기름 한 방울을 배치하고, 100X 목표로 전환합니다. 카메라 광학 경로를 반환합니다. </li><li> 십자형 커서의 중앙 아래에 선택의 신경 세포를 이동하려면 마우스를 사용합니다. 레이저를 발사하기 위해 발 페달을 눌러 프로세스의 연결을 끊을 수. 필요한 경우, 펄스의 두 세트는 신경을 도려 사용할 수 있습니다. 처음에는 그것은 뉴런이 이후의 재생을 평가하기 위해 각각의 벌레에 심했을텐데 보유하고있는 정확하게 추적하기 위해 도움이됩니다. 제대로 수행되면, 레이저 axotomy은 주변 피부 조직이나 다른 뉴런 (그림 3 참조)에 상당한 손상을 초래하지 않고 신경 세포의 작은 휴식을 생산하고 있습니다. 어떤 경우에는 작은 상처는 부상의 사이트의 주위에 양식 있습니다. </li><li> 벌레는 아가로 오스 패드에 남아있을 것을주의하고, 직접 상향 움직임에 커버 슬립을 제거하여 벌레를 복구합니다. coverslip를 밀어하지 마십시오. 그런 다음, 바늘 코를 집게로 웜 주변의 패드를 잘라 OP50 8 포함된 갓 씨앗 NGM의 접시에 아가로 오스의 섹션을 놓으십시오. 구슬에서 벌레를 무료로 아가로 오스를 제거하는 패드에 멸균 M9 10 μL를 놓습니다. </li></ol> 5. 재생에 대한 점수 뉴런 <ol><li> 단계 2.2에 명시된 바와 같이 아가로 오스 패드를 준비합니다. </li><li> 3-5 &amp;에 플레이스 웜뮤, 폴리스티렌 구슬 L. coverslip을 적용합니다. 슬라이드는 순차적으로 준비하거나, 또는 모든 벌레는 사전과 10cm 문화 요리, 아가로 오스의 촉촉한을 유지하기 위해 습기가 Kimwipe를 포함하는 각에 보관 슬라이드에 준비하실 수 있습니다. </li><li> 잘린 신경을 시각화하기 위해 100X 목적을 사용합니다. 많은 뉴런에서 절단 사이트에 말초의 연결 그루터기가 유지됩니다. 우리는 신경 세포가 실제로 (그림 4) 절단이라고 ​​표시로 잔여의 존재를 사용합니다. 이 유세의 존재는 그것이 가능 잘라 아니었 하나 잘라 생성되었습니다 신경 세포를 구별할 수 있습니다. 참고 : 모두 말초 및 근위 스텀스 처음 절단 후에 철회. </li><li> 중생을 평가합니다. 매개 변수의 다양한 결정하실 수 있습니다. 하나의 간단한 분석은 부상당한 신경 세포가 성장 원뿔 (그림 4A)을 형성하고 (그림 4B)하지 생성, 또는이 있는지 여부입니다. 또는, neurite의 길이는 추적하고 비교할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 예를 들어, 우리는 γ - Aminobutyric의 산성 (GABA) 모터 뉴런의 중생의 특성을 설명합니다. 복부 신경 코드에 거주하고있는 특정 신경 코드에 circumferentially 프로세스를 확장하는 이들 뉴런은, 적절한 운동 9 필수적입니다. GABA의 신경은 UNC -47 또는 UNC의 통제 -25 발기인 (C. 엘레간스 유전 센터에서 사용할 종자 각각 EG1285 및 CZ1200, 아래와 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 같은 유전자 인코딩 형광단을 표현하여 시각 수 있습니다 ). 마운트 L4 단계의 웜은으로 설명, 자신의 오른쪽 측면에있는 GABA 뉴런가 직면하므로 벌레를 플립하고, 표지 용지를 넣으십시오. 지느러미와 복부 코드 사이의 각 웜, 미드웨이에서 사후 commissures의 1-3 컷. 다음과 같이 다른 commissures와 교차 또는 fasciculate 나중에 점수 어렵다는 것을 commissures을 절단하지 마십시오. 설명한대로 벌레를 복구할 수 있습니다. 18~24시간 성공 axotomy 후, 웜는 수술에서 회복하고 정상적인 locomotory 달걀 누워있는 행동을 전시됩니다. 죽거나 아픈가요 벌레를 폐기하십시오. 설명된대로 나머지를 리마운트하고, 중생을 평가합니다. 우리는 일반적으로 실험 조건마다 적어도 30 컷 뉴런을 평가하는 것을 목표로하고 있습니다. oxIs12 동물, 절단 L4 GABA 뉴런의 일반적 60-70%은 끝에 여러 neurite 지점의 확장에 막의 확대, 그리고 컷 사이트 (그림 4A)에서 마이 그 레이션에 의해 입증 성장 원뿔 구조를 시작합니다. 대부분의 경우에는 성장 콘은 지느러미 신경 코드, 인근의 연결을 접합면 또는 말초 그루터기와 재연결으로 마이 그 레이션해야합니다. 뉴런의 나머지 30 % 중 axotomy의 사이트에 근위 그루터기을 형성, 아무 성장을 시작하지 않았기에, 아니면 작은 filopodia (그림 4B)을 확장합니다. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. UV 레이저 axotomy 시스템을 펄스. 특정 구성 요소는 다음과 같습니다 (A) ND 필터는 (B) 펄스 선택 (C) 필터 휠 레버 (D) 레버 (E) 레이저 셔터 및 (F) 감쇠기 플레이트 전환 광학 경로입니다. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 아가로 오스 패드를 준비. 원하는 두께의 아가로 오스 패드를 준비하려면, 테이프의 두 계층은 (녹색) 2 슬라이드에 표시됩니다. 슬라이드는 첫 번째와 두 번째 사이에 위치하고, 아가로 오스의 드롭은 다음 깨끗한 슬라이드에 추가됩니다. 마지막으로 네 번째 슬라이드 테이프 두 조각의 두께는 패드의 결과, 처음 세에 수직으로 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 대표 GABA 신경 세포의 axotomies. 전형적인 실험에서는 GABA 신경 세포의 commissures는 웜 측면의 중간에서 절단됩니다. 절단 접합면 바로 전 (왼쪽 패널) 및 (오른쪽 패널) axotomy 후 표시됩니다. 모든 이미지는 100X 오일 목적으로 찍은. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. GABA 신경 세포의 axotomies 대표 발생합니다. 24 시간 이후 axotomy 절단 axons은 중생에 대한 점수입니다. 성장 원뿔 (화살표)와 재생의 축삭은 (A)가 아닌 재생 축삭은 (B)에서 근위 그루터기 (화살표)로 볼 수있는 동안에 표시됩니다. 각 컷 축삭의 말초 그루터기는 각 패널 (화살촉)에 표시하고 축삭이 절단되었다는 표시입니다.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans.">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li><li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

레이저 시스템의 다양한 C.에 neurites를 잘라하는 데 사용되었습니다 엘레간스, 여러 연구 세부 3,7,10,11에서 성능을 검사했습니다. 우리의 프로토콜에 사용되는 MicroPoint 레이저는 설치 및 유지 관리가 용이​​하고, 티 - 사파이어 레이저 시스템에 비해 연구자에게 저렴한 비용으로 사용할 수있는 턴키 시스템입니다. 티 - 사파이어 시스템에 비해 그러나, MicroPoint 레이저는 일부 응용 프로그램에 대한 불리한 수있는 더 큰 영역에 손상을 일으킬 것으로 예상된다. 티 - 사파이어 시스템을 원하는 경우, 이러한 시스템 구축에 우수한 프로토콜은 12 사용할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 C로 뉴런의 다양한 수행할 수 엘레간스는 있지만, 우리는 뉴런의 독특한 유형 간의 재생 능력의 차이가 13 예상됩니다. 또한, 다른 유전자 변형 배경 재생 성공에 영향을 줄 수 있습니다. 재생 GABA 뉴런의 비율이 다른 유전자 변형 종자 마커 사이의 매우 일관하지만, 우리는 oxIs12 15 웜 대 juIs76 14 재생에 전반적인 약간의 증가를 언급했습니다. 터치 뉴런의 마커 사이의 차이도 2 설명하고 있습니다. 비즈보다 빠르고 일관성있는 고정 16 결과로 우리는 오히려 anesthetics보다 microbeads로 벌레를 무력화하는 것을 선호합니다. 우리가 재생 마취 17 때문에 가능한 모든 혼란함을 주죠 효과를 무료로 관찰 할 수 있으므로 이것은 또한 유리한 것입니다. 고정을위한 대안 마취없는 방법 microfluidic 장치의 사용이다. axotomy위한 microfluidics의 사용은 광범위 17-22을 설명하고 있습니다. 우리는 각 주 MicroPoint 설명서에서 설명한 절차에 따라 한 일관성을 사용하여, Coumarin는 염료 셀에 440 최고의 레이저 기능이 변경됩니다 것을 발견했습니다. 필요한 경우, 감쇠 슬라이더는 전력을 증가하는 데 사용할 수 있지만, 이것은 오래된 염료 또는 레이저 misalignment의 표시 수 있습니다. 또한, 염료 전지는 제한된 수명을 가지고 있으며, 결국 (문제 해결 참조) 재건하거나 교체해야합니다. 그것은 동물이 불완전 마비 특히 경우, 레이저 초점을 표시 주목을 아래 대상 neurite를 기동하기 어려울 수 있습니다. 우리는 확실히 사용할 수 있지만 수동 무대,이 목적을 위해 최적되지 않습니다 것을 발견했습니다. 조이스틱 제어 전동 단계 더 정확하고, 우리는 전동 무대를 이동하려면 마우스로 드래그 이미지를 지원하는 소프트웨어를 사용하는 것이 가장 좋습니다 것을 발견했습니다. 니콘 요소는이 기능을 제공하며이 프로토콜의 설명이지만, 무료 마이크로 패키지뿐만 아니라 다른 이미징 소프트웨어는 비슷한 기능을 가지고 있습니다. 고급 타겟팅 다른 방법으로 오히려 동물보다 레이저 초점을 이동하는 것입니다. 검류계 빔 - 스티어링 메커니즘으로 사용할 수 있습니다 MicroPoint 레이저에 애드온 (add - on), 이러한 방식이 선호하는 경우. 의 연결을 중생의 연구에의 응용 게다가, 레이저는 다른 세포 유형 같은 피부, 근육, 또는 전문 세포로 ablate하거나 특정의 연결 시냅스에게 23-27를 중단하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 부상 또는 질병 함께 뉴런의 변성을 조절 경로는이 시스템 조사 수 있습니다. 이와 같이, 펄스 레이저의 사용은 중생의 연결 및 기타 관련 프로세스를 촉진 유전 요인과 세포 생물 학적 변화 모두에 대해 설명해 주실 것입니다. 문제 해결 : 몇 가지 일반적인 문제와 관련된 솔루션은 여기에 설명되어 있습니다. <ol type="a"><li> 레이저 커팅 제대로되지 않습니다. 중 레이저 (섹션 2 참조) 초점 밖으로 있기 때문에이 가능성이 높습니다, 또는 염료를 세포에 염료 (MicroPoint 설명서를 참조) 교체해야합니다. 또는, 염료 전지를 교체하거나 재건해야 할 수 있습니다. </li><li> 벌레는 아가로 오스 패드에 이동됩니다. 이것은 일반적으로 아가로 오스 패드가 너무 습한 것을 서명합니다. 우리는 패드는 벌레가이 문제를 회피하기 위해 그들에 배치되기 전에 약 30 초 동안 남아있을 필요가 찾으십시오. 당신은 또한 작은 크기의 (0.05 μm의) microbeads를 사용하여 시도할 수 있습니다. </li><li> 벌레의 복구는 어렵고 비효율적이다. 이것은 잘못된 coverslip 제거하거나 건조한 아가로 오스 패드로 인해 발생할 수 있습니다. 패드가 너무 건조하면 axons가 페르시 모양을 개발하는 것을 확인할 수 있습니다. 벌레가 곧 그것이 만들어진 후 패드에 배치되지 않았기 때문에 어떤 경우에는이됩니다. 또는 아가로 오스 솔루션의 오래된 재고가 반복 용해 후보다 높을 3 % 농도가있을 수 있습니다. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 0.05 μm의 폴리스티렌 비즈 </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 08,691 </td><td></td></tr><tr><td> 0.10 μm의 폴리스티렌 비즈 </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 00,876 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 GPG / LE </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> 00,972 </td><td> 울트라 순수 </td></tr><tr><td> 팰컨 14 ML의 폴리스티렌은 라운드 - 하단 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 X 100mm 스타일, nonpyrogenic </td></tr><tr><td> 써모 과학 일반 precleaned 현미경 슬라이드 </td><td> 에리 과학 회사 </td><td> 420 - 004T </td><td> 3 &quot;X 1&quot;X 1mm </td></tr><tr><td> 커버 버렸는데 </td><td> VWR </td><td> 48,366 205 </td><td> 18mm X 18mm 번호 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH 과학 Kimwipes </td><td> 킴벌리 - 클라크 </td><td> 34,155 </td><td></td></tr><tr><td> BD 팰컨 100 X 15mm 스타일 페트리 접시 </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> 테이프 빈 3/4w X 500L </td><td> TimeMed </td><td> T - 512 </td><td></td></tr><tr><td> 집중 오일 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> , ND는 = 1.515를 입력하십시오 </td></tr><tr><td> EG1285 또는 CZ1200 </td><td> C. 엘레간스 유전 센터 </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> 사전 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS - 요소 아르 또는 브랜치 도서관 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MicroPoint 박리 레이저 시스템 </td><td> 과학 광자 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 복합 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 80i </td><td></td></tr><tr><td> 하마 마츠 카메라 </td><td> 하마 마츠 Photonics </td><td> 모델 C8484 - 05G01 </td><td></td></tr><tr><td> 인텔 코어 2 듀오와 델 정밀 T3400 PC </td><td> 작은 골짜기 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 윈도우 XP 프로 페셔널 </td><td></td><td> 마이크로 소프트 </td><td> 버전 2002 시리즈 팩 3 </td></tr><tr><td> 듀얼 건식 목욕 보육 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td></td><td> 아날로그 제어 </td></tr><tr><td> 4X 계획 플루어 목적 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X 계획 APO VC 오일 목적 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 더몬트 # 45분의 5 포셉 </td><td> 더몬트 </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel 표준 조언도 # 7을 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> SMZ800 </td><td> NI - 150 고강도 조명기과 함께 </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

뉴런은 axons과 dendrites, 사전 또는 사후 신경 전문을 포함 슬림 멤브레인 확장을 통해 다른 세포와 통신합니다. 신경 세포가 부상 또는 질병에 의해 손상된 경우, 재생 수 있습니다. 셀 - 내장 및 외부 요인이 기능을 재생 및 복원하는 신경 세포의 능력에 영향을 미칩니다. 최근 선충류 C. 엘레간스은 유전자를 식별하는 훌륭한 모델 생물로서 등장과 뉴런 1-6의 재생에 영향을 미치는 경로를 신호했다. C로의 연결을 재생을 시작하는 주요 방법 엘레간스는 레이저 커팅 중재, 또는 axotomy입니다. axotomy 동안 찬란 - 라벨의 연결 과정은 높은 에너지 펄스를 사용하여 절단합니다. C로 처음의 연결 재생 엘레간스는 증폭 femtosecond 레이저 5를 사용하고 검사했다. 그러나, 이후의 재생 연구는 종래의 펄스 레이저가 정확하게 생체내에 신경을 도려하고 유사한 응답 재생 1,3,7을 이끌어하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 MicroPoint 펄스 레이저, 즉시 사용할 수 있고 그것이 널리 타겟 세포 절제에 사용되고 있습니다 턴키 시스템을 사용하여 웜에서 생체내 레이저 axotomy에서 수행하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 레이저를 정렬 벌레를 장착, 특정 신경을 절단하고, 후속 중생을 평가 설명합니다. 시스템은 한 실험 기간 동안 여러 벌레의 뉴런의 큰 숫자를 줄일 수있는 기능을 제공합니다. 따라서, 본 설명과 같은 레이저 axotomy은 중생의 과정을 시작하고 분석을위한 효율적인 시스템입니다.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

에 신경을 절단하는 프로토콜<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; MicroPoint 펄스 레이저가 함께 제공됩니다. 우리는 벌레를 immobilizing, 시스템을 설정하고, 레이블 뉴런을 severing 설명합니다. 장점은 상대적으로 낮은 비용으로 시스템 및 프로세스의 연결 또는 ablate 세포를 도려 수있는 능력을 포함<em&gt; 생체내에</em&gt;.

C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

18.1K 조회수.  Yale University School of Medicine. 에 신경을 절단하는 프로토콜 C. 엘레간스 MicroPoint 펄스 레이저가 함께 제공됩니다. 우리는 벌레를 immobilizing, 시스템을 설정하고, 레이블 뉴런을 severing 설명합니다. 장점은 상대적으로 낮은 비용으로 시스템 및 프로세스의 연결 또는 ablate 세포를 도려 수있는 능력을 포함 생체내에.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans 추적 및 행동 측정

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...