저자 프로토콜의 개발 지원을위한 A. Benham 감사드립니다. 이 작품은 BAB에 NIH 교부금 NS06747 추진하는 사업

1. 이미징에 대한 웜의 작성 프로토콜의이 세그먼트는 게시 C. 기반으로 elegans 문화 기술 1,2, 그리고이 그림 1에 설명되어있다. <ol><li> NA22 E. 높은 펩톤 NGM 한천 플레이트 (10 ㎝) 씨앗에 벌레를 성장 대장균 박테리아는 거의 굶어까지. immunostaining 경우, 한 접시가 안정적으로 길을 따라 계정 손실을 고려하고, 영상에 대한 웜 (파트 2 참조)을 선택하는 데 사용되는 엄격한 기준, 얼룩 한 개인에 대한 충분한 벌레를 생산합니다. </li><li> 접시에 ddH 2 0 몇 ML를 따르고 의한 수확 웜, 간략하게 소용돌이 치는, 그리고 15 ML 원뿔 튜브 (반복 튜브에 벌레의 대부분을 전송하기 위해 필요한 경우)에 액체를 붓는. 3 분, 1000x g 대한 임상 원심의 펠릿. 뜨는가 잔류 세균을 제거해도 좋다 때까지 ddH 2 O로 1 배 펠릿 씻으십시오. 벌레가 유리에 집착로 supernatants를 제거하는 폴리 프로필렌 전송 pipettes를 사용하여(이 단계 이후부터 그것은 계란 생존의 손실을 방지하기위한 조치 사이의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.) </li><li> 마지막 세척 후 resuspend 웜 펠렛은 5 ML 알칼리성 염소산 용액에 웜 및 릴리스 계란을 lyse합니다. 부드럽게 바위, 약 한 분당 해부 현미경 하에서 튜브를 검사합니다. 벌레의 약 50 %가 (그들은 구부 러와 오픈 깨진 나타납니다) lysed 때, 계란 버퍼, 반전 여러 번으로 맨 위로 튜브를 충전하고, 3 분, 1000x g을 위해 pelleting하여 용해를 종료할 수 있습니다. 용해 시간은 5 분 초과할 수 없습니다. </li><li> 전달 피펫으로 뜨는 제거하고 계란 버퍼와 함께 펠릿 배 씻는다. </li><li> 파편으로부터 계란을 분리하려면 ddH 2 O의 30 % 자당의 쿠션에 흘려 보내곤 : 1.4 단계에서 최종 세척 후 신중 5 ML ddH 2 0에서 뜨는 및 resuspend 펠릿를 제거합니다. ddH 2 O 5 ML 멸균 60 % 자당을 추가하고 잘 섞는다. 임상 원심 분리기로 6 분, 1000x G를 봐. 계란은 (그들이 저기에됩니다 초승달 모양으로 수집합니다) 흐린 모양이 있어요, 파편 펠릿 하겠읍니다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 최소한의 볼륨에 계란을 빨고 unseeded NGM 한천 플레이트로 전송합니다. 튜브의 측면을 지키는 모든 계란이 부드럽게 아래로 씻어서 잘으로 전송할 수 있습니다. 한 10cm는 분석 스트레인 당 플레이트가 충분 unseeded. </li><li> 20 하룻밤 달걀 (~ 16 시간) ° C.로 unseeded 번호판을 품어 몇 시간 동안 약간 떨어져 뚜껑을 떠나는하여 건조 처음 몇 시간 동안 번호판을 빼낼하지만 하룻밤 사이에 충당해야합니다. </li><li> 부화 후, S의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는에서 15 ML 원뿔 튜브 (관에 부어, 몇 ML S 플레이트에 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 소용돌이 추가)로 L1의 유충을 전송. 임상 님의 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중 최소 볼륨에서 resuspend 원심 분리기 (3 분, 1000x G), 그리고 NA22 박테리아 놓는 10cm의 NGM 한천 플레이트로 전송에서 펠릿. 1.1 단계에서 각 원본 판은 여기 두 접시를 사용합니다. 벌레가 원하는 연령에 도달할 때까지 알을 품다. </li><li> 한 두 번 하루에 문화를 모니터링합니다. 그들은 위험 O에있는 경우F 굶주리고, 신선한 NA22 플레이트로 전송. 야생 형 N2의 웜 들어, 기아는 동물들이 멀리 식품 고갈 영역에서 실내 masse을 마이 그 레이션으로 번호판을 가로질러 이동하는 벌레의 라인이나 파도의 형성에 의해 선행된다. 이 양식되면, 음식 완전히 몇 시간 이내에 소진됩니다. </li><li> 웜 지금 immunostaining 또는 라이브 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 그대로 웜 다수가 쉽게 몇 군데 수 있기 때문에 문제점을 해결하는 서스펜션의 벌레를 더럽히는 것은 최적입니다. 웜 다수가 영상에 필요한되기 때문에 Finney와 Ruvkun 프로토콜 3-6을 바탕으로 염색법 절차는 동결 균열 절차 바람직합니다. </li></ol> 2. 공촛점 이미징 <ol><li> 공촛점 이미징을위한 슬라이드에 벌레를 탑재합니다. microliter 당 몇 백에 벌레의 밀도를 조정합니다. 관련 2퍼센트 아가로 오스의 패드를 만들어 S-기저 (컷 - 오프 25 게이지 바늘로 장착되어 3 ML에 주사기를 통해 적용) 이미징 동안 증발을 방지하기 위해 바셀린의 얇은 고리에 둘러싸여. 를 피펫커버 슬립 진입 웜 정지 몇 microliters은 (영상 라이브 웜 경우 마취제를 사용하여), 그리고 커버 슬립에 아가로 오스 패드를 낮추고, 패드 위에 고르게 웜 확산. </li><li> 이미징에 대한 웜을 선택합니다. ± 45 ° (0 °가 직접 목표 방향으로 지향적인 의미 임)보다 관심이 시냅스는 더 이상의 방사상 변위와 함께 객관적인 렌즈쪽으로 방향 웜을 선택합니다. photobleaching 피하기 위해 (몇 초) 신속하게 이러한 평가를 수행합니다. 초기 문화의 규모는 충분한 웜 이러한 기하학적인 기준을 충족하도록 최적화되어 있습니다. </li><li> 표본의 공촛점 이미징을 완료합니다. 0.4 약 14 μm의 두께 구역 내에 포함하고 있습니다 비교적 평평한 샘플은 최상의 결과를 생산하고 있습니다. 높은 속도, 낮은 해상도 이미지 (512 X 512 픽셀) 급속한 정확한 데이터 수집을위한 충분한입니다. 이것은 형광의 싼 견적을 일으킬하므로 포화에게 과도한 신호 강도와 검출기를 피하십시오신호. </li></ol> 3. 개인 시냅틱 클러스터의 자동 식별 및 분석 <ol><li> 오픈 멀티 TIF 출력 Volocity 4.0 (이상) 소프트웨어 (PerkinElmer)를 사용 공촛점 현미경에서 파일. </li><li> 자르기 떨어진 관심의 구조가 포함되지 않은 이미지의 영역 (이미지 -&gt; 확장 포커스 -&gt; 작업 - - &#39;자유형 투자 수익 (ROI)&#39;도구를 사용하여 관심&gt; 선택 영역 선택으로 돌아가기&gt; 자르기, 그림 2A). 참고 확장 초점은 분석을 돕기 위해 컴퓨터 화면 Z-평면 투영을 생산하지만, 기본 데이터에 영향을주지 않으며 동일, 필요한 경우) 밝기 및 대비 조정을위한 사실이다. </li><li> 선 도구를 사용하여 분석 영역의 길이를 측정합니다. 라인의 길이를 계산하고 데이터 테이블 (그림 2B)에 추가됩니다. </li><li> 필터 (측정 모드) &#39;강도에 의해 객체&#39;를 사용하여 개체를 식별합니다. 시냅스 클러스터가 그러한 한계를 지정강조와 비 시냅스 배경은 (그림 2C)되지 않습니다. 다른 색상으로 표시하는 독립적인 시냅스 마커의 포함은 시냅스를 식별 unambiguously 도움이 될 수 있습니다. 전형적인 시냅스는 몇에서 몇 백 voxels로 다양합니다. 컨트롤 샘플을 사용하여 한번 임계값을 설정하고, 이후의 모든 샘플을 위해 사용합니다. 그것이 실험자 바이어스의 가능성을 소개하기 때문에 각 예제를 Thresholding 것은 별도로 받아 들일수 없죠. 개체가 선택되고 (그림 2D) 자동으로 표로하고 있습니다. </li><li> 정렬 및 데이터를 내보냅니다. 이들은 보통 배경 점들 때문에, 2 개 이하 voxels의 개체를 제거합니다. 이러한 추가적인 필터링에 의해, 또는 후속 분석하는 동안 제거될 수 있습니다. &#39;개체 크기&#39;하여 제거 하류, 다시 정렬 데이터 파일을 촉진하기 때문에 그들은 모두 그룹이 함께합니다. Microsoft Excel 또는 다른 스프레드 시트 프로그램에서 열 수 CSV 형식에서 데이터를 내보냅니다. 각 이미지는 하나의 출력 파일을 생성합니다. </li><li> 만약 Volocity의 소프트도자기를 사용할 수 없습니다, 다른 방법은 3 차원 정보가 손실됩니다 있지만 (토론 참조) (예 : 심판. 7 또는 ImageJ를 사용하여 수동 분석) 활용할 수 있습니다 공촛점 데이터의 Z-비행기 전망을 분석하는 것입니다. </li></ol> 4. 대표 결과 제시 부량 방식은 서로 다른 밝기와 다른 볼륨의 클러스터 인구를 구분할 수 있어야합니다. 그림 3에 제시된 대표 이미지와 해당 양적 데이터는 이러한 매개 변수에 기초하여 차별의 예를 보여줍니다. 일반적으로 결과는 눈에 분명 무엇을 따라야한다. C의 복부 신경 코드를 immunostaining UNC-49 GABA 수용체의 경우 elegans, 모든 동물은 일반적으로 크기와 성숙에 매우 유사한 나타나 다섯 웜의 그룹 (분석 신경 코드의 길이로 정규화)에 대한 총 시냅스 형광 값은 표준 오류를 보여주<html> 평균 4의 약 10 %의 가치. 유전자 돌연변이 및 기타 실험적인 트리 트먼트 (예 : 약물 노출) 볼륨과 강도 가치와 시냅스 클러스터의 주파수 분배뿐만 아니라 변경할 수 있지만, 아마도, 시간 코스와 웜의 synchrony 발달은 높은 변화로 이어지는. 그러나 정량 결과는 항상 오류가 발생하고 다시 thresholding 또는 artefactual 객체의 제거 등 시정 조치를 제안하는 위치를 공개해야 Volocity으로 식별 이미지와 개체의 검사, 시각 및이 아니라면 감상할 수 있습니다 무엇 반영한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> 1 그림. 동기식 C.의 작성 elegans 문화. 동기 문화가이 과정에서 얻은되어 있기 때문에 C. elegans 개발 체포 및 식품의 부재에서 L1 애벌레의 무대, 그리고 음식이 소개되었을 때 다시 시작합니다. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> 그림 2. 시냅스 puncta의 Quantitation. <ol class="ualpha"><li> 이미지의 필요없는 영역은 파일 크기를 줄이고 특이성을 높이기 위해 자른있다. 왼쪽 패널은 이미지를 시작 보여주고, 중간 패널은 선택된 영역을 보여주는, 오른쪽 패널 자르기 후 이미지를 보여줍니다. 빨간 신호가 UNC-49 GABA 수용체 immunofluorescence이며, 녹색 신호가 presynaptic GABA 뉴런 4에서 표현 synaptobrevin-GFP (presynaptic 마커)입니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . </li><li> 선 분석되는 신경 코드 세그먼트의 길이를 그려 있으며, 그 길이가 자동으로 결과를 테이블에 기록됩니다. 이 정보는 벌레가 염색법 도중에 조각되어있다면 몇 배 다를 수 analyzable 신경 코드의 길이로 인해 시냅스 데이터를 정상화하는 데 필요합니다.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. </li><li> 임계값은 개별 시냅스 클러스터를 식별하는 데 적용됩니다. 왼쪽 패널 thresholding 전에 이미지를 보여주고, 다른 thresholding 수준의 예제는 별도의 패널 (녹색 신호가 생략)에 표시됩니다. 각 확인된 개체는 색 영역으로 이미지 그려져 있습니다. 가장 왼쪽 패널에서 시각적으로 확연히 시냅스 클러스터와 가장 오른쪽 패널의 컬러 영역 간의 통신을 확인합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . </li><li> 각 확인된 개체는 결과 테이블에 별도로 나열됩니다. 개별 개체가 선택될 수 있으며, 원하는 경우 검사 이미지를 강조 표시됩니다. 저 테이블은 빨간색 ( &#39;rhodamine&#39;)과 녹색 ( &#39;EGFP&#39;) 채널에 대한 정보가 포함되어 있습니다; 객체 였을 때부터 녹색 채널 정보는 잠재적으로 잘못된 것입니다엄격히 적색 형광을 기반으로 밝혀졌습니다. 이 분석은 또한 하나의 컬러 이미지에서 수행됩니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> 그림 3. 대표 결과입니다. 대표 micrographs 야생 형 C.부터 전에 UNC-49 GABA 수용체에 대해 묻다 elegans ()와 muscimol, 장기 노출 후 downregulated 될 수용체를 일으키는 GABA 수용체 작용제와 (B) 치료 후. 패널은 전 (왼쪽)와 (오른쪽) thresholding과 작은 배경 얼룩의 제거 후 자른 이미지를 보여줍니다. (C)과 같이 표본에 대한 정량 시냅스 매개 변수의 음모 (A)와 (B) : 총 형광 용기는 코드 길이 (왼쪽) 및 누적 확률 histograms 개별 시냅스의 형광 컨텐츠 (가운데)와 시냅스 볼륨 (맞로 정규화T), 작용제 노출 (muscimol-치료를위한 치료, N = 115 시냅스를위한 n은 = 60 시냅스에 의해 유도된 시냅스 내용과 볼륨에서 통계적으로 의미있는 감소를 시연, P &lt;0.001, Kolmogorov - 스미 르 노프 검사 <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / 통계 / KS-test.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기에 제시된 방법은 C.에있는 시냅스의 대규모 인구에 대한 정량 멀티 파라미터 데이터를 추출하도록 설계되었습니다 elegans, 치료 그룹 내에서 일관성을 극대화하면서. 세 가지 특징은 이러한 목적에 기여한다. 첫째, immunostaining 모든 동물들이 같은 나이가되도록 동기 웜 집단에서 수행됩니다. 표현 수준의 발달 규정 실험적 치료의 효과를 흐릿하게 수 있기 때문에이 단계는 중요?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 소프트웨어의 이름 </td><td> 회사 </td><td></td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Volocity V4.0 이상 </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> 이 소프트웨어에 액세스하려면 로컬 이미징 핵심 시설을 확인합니다. 데모 소프트웨어는 PerkinElmer 웹사이트에서 사용할 수 있습니다. 이 방법은 Volocity만을 Quantitation 모듈이 필요합니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 특정 시약 및 장비. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 계란 버퍼 </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (7.3로 산도를 조절) </td> &lt;TD&gt; 118 MM 48 MM 이 MM 이 MM 24 MM </td></tr><tr><td> 알카라인 차아 염소 산염 (5 ML 용) </td><td> 신선한 가정용 표백제 (30 일 개장 이후 병을 폐기) 10 N NaOH ddH 2 O </td><td> 1.0 ML 0.25 ML 3.75 ML </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 솔루션. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

시냅스 강도는 presynaptic 신경 전달 물질 릴리스 행사 postsynaptic 응답의 진폭을 참조하고, 전반적인 신경 회로의 기능에 큰 영향을 미치고 있습니다. 시냅스 강도가 매우 postsynaptic 멤브레인에서 시냅스 사이트에서 클러스터된 신경 전달 물질 수용체의 풍부에 따라 달라집니다. 수용체 레벨이 발달 설립되며, 시냅스 소성 및 neuromodulation의 중요한 메커니즘을 나타내는 표면화된, subsynaptic, 그리고 세포 내 수영장, 사이 수용체 인신 매매에 의해 변경될 수 있습니다. synaptically-화된 신경 전달 물질 수용체 풍요로움을 계량하기위한 엄격한 방법은 시냅스 개발 및 소성을 공부하는 것이 필수적입니다. 그것이 아닌 시냅스 수영장에서 시냅스 구별, 그리고 시냅스의 다른 유형에 지역화된 수용체 인구들 사이에서 차별, 공간 정보를 유지하기 때문에 형광 현미경은 최적의 접근 방식이다. 유전자 모델 생물 Caenorhabditis elegan의은 특히 손상 동물의 네이티브 시냅스의 시험을 수 있도록 작은 크기와 상대의 신경 계통의 단순화, 투명성, 그리고 강력한 유전자 기술의 가용성으로 인해 이러한 연구에 가장 적합합니다. 여기에서 우리는 C.에 fluorescently-라벨이 시냅스 신경 전달 물질 수용체를 quantifying위한 방법을 제시 elegans. 그 주요 기능은 멀티 비행기 공촛점 현미경 출력 파일, tabulating 위치, 볼륨, 형광 강도 및 각 시냅스에 대한 전체 형광 세 차원에서 개별 시냅스의 자동 식별 및 분석입니다. 이 접근법은 공촛점 데이터의 Z-비행기 예측의 수동 분석을 두번 주요 장점이 있습니다. 공촛점 데이터 집합의 모든 비행기가 포함되어 있기 때문에 첫째, 어떤 데이터는 일반적으로 화소 농도의 평균이나 맥시멈을 토대로 Z-평면 투영을 통해 손실되지 않습니다. 시냅스의 둘째, 신분증은 자동이지만, 예전에 의해 검사를 수시냅스 다수의 데이터를 신속하고 정확하게 추출 수 있도록 데이터 분석 진행 등 perimenter. 샘플 당 시냅스 수천 수백 쉽게 큰 데이터를 생산하는 통계 능력을 극대화할 수 설정, 얻을 수있다. C를 준비하기위한 고려 사항 분석 및 치료 그룹 내에서 동물 간의 다양성을 최소화하기 위해 공촛점 이미징을 수행하기위한 elegans도 설명합니다. C를 분석하기 위해 개발된 있지만 elegans postsynaptic 수용체가이 방법은 실제로 synaptically-화된 단백질, 또는 개별 클러스터, puncta 또는 organelles에 현지되는 형광 신호의 모든 유형에 대해 일반적으로 유용합니다. 절차는 세 단계로 수행됩니다 : 1) 표본 2의 준비)를 공촛점 이미징, 그리고 3) 이미지 분석. 단계 1과 2는 C.에만 해당 elegans, 3 단계는 일반적으로 공촛점 micrographs에 작은 반점이있는 형광 신호에 적용할 수있는 동안.

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를 quantifies<em&gt; C. elegans</em&gt;, 시냅스 수백이 빠르게 Z-평면 투영에 의해 도입 왜곡없이 하나의 샘플 내에서 특성화 수 있도록.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K 조회수.  University of Toledo. 시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를 quantifies C. elegans, 시냅스 수백이 빠르게 Z-평면 투영에 의해 도입 왜곡없이 하나의 샘플 내에서 특성화 수 있도록.

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Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

연구

신경과학

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans 추적 및 행동 측정

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

의 자동 분석<em&gt; C. 엘레</emCeleST 소프트웨어를 사용&gt; 수영 동작

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...