암세포는 세포 외 환경에서 ATP와 같은 영양소를 내면화하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 우리의 프로토콜은 ATP 내산화를 입증하고 세포 내에서 ATP 지역화를 시각화 할 수 있습니다. 거형화 내의 내부ATP의 고해상도 이미징은 특수 현지화를 이해하고 내재화 분석 수량을 완료하는 데 이상적입니다.
이 프로토콜은 ATP 내재화를 연구하기 위한 다양한 실험 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법은 거형 세포 세포증 및 엑소좀 매개 내분법을 포함하여 세포 내재화의 다른 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 대사 질환의 경우 비암 세포에서 ATP 내산화를 이 프로토콜로 연구할 수 있습니다.
시작하려면, FBS와 항생제로 보충 DMEM을 포함하는 225 평방 센티미터 플라스크에 암세포를 종자. 세포배양배양에서 세포가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 성장할 수 있도록 합니다. 일단 80%의 합류가 달성되면, 세포와 펠릿을 원심분리에 의한 분리세포를 분리하고, PBS의 100마이크로리터당 6세포의 5배 10~6세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 얼음감기 PBS에서 세포를 재연한다.
세포 현탁액을 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 면역 결핍 마우스의 측면에 주입 부위를 청소, 75%에탄올, 섬세한 작업 닦아와 여분의 에탄올을 닦아. 27 게이지 정밀 글라이드 바늘이 장착된 1밀리리터 라텍스 프리 주사기로 셀을 그립니다.
피하 주사의 경우 바늘을 피부에 약 10도 각도로 잡고 피부 아래를 향한 벨이 있는 바늘 끝을 삽입하여 피부 바깥쪽에 바늘을 1~2밀리미터만 유지합니다. 주사기에서 세포를 약 10초 이상 천천히 분배합니다. 전체 부피를 주입 한 후 바늘을 3 ~ 5 초 동안 제자리에 고정한 다음 바늘을 철회하십시오.
주입된 내용물의 누출을 방지하기 위해 손가락으로 3~5초 동안 사출 부위에 부드럽지만 단단한 압력을 가하십시오. 종양이 200 ~500 입방 밀리미터의 부피에 도달할 때까지 Vernier 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 모니터링하고 측정합니다. 밀리리터 고분자 중량 형광 덱텐과 세럼이 없는 DMEM당 16밀리그램의 마이크로리터 300마이크로리터를 녹이고, 30분 동안 섭씨 37도에서 강화된 수조에서 배양한 다음, dextran 용액을 원심분리하고 초퍼를 새로운 1.5밀리리터 미세산경선으로 옮기다.
40 마이크로리터에서 1밀리미터 비 가수 분해성 형광 ATP 아날로그 스톡을 160 마이크로리터의 혈청 이없는 DMEM에 공급하여 0.2 밀리머라 비가수분해성 형광 ATP 솔루션을 만듭니다. DMEM의 고분자 또는 저분자량 형광 dextran당 8밀리그램의 치료 솔루션을 DMEM의 100 마이크로몰러 비하이드로졸 형광 ATP의 유무에 관계없이 이전에 제조된 스톡 솔루션을 혼합하여 준비합니다. 1 밀리리터 주사기를 사용하여 하나의 치료 용액 50 마이크로리터를 수집합니다.
xenograft 종양에 직접 용액을 주입하고 각 치료의 4 개의 생물학적 복제를 반복하십시오. 마우스를 안락사시키고 종양 조직을 격리한 후 천공 된 숟가락을 사용하여 절제된 종양 조직을 떠서 즉시 조직을 동결 배지에 넣고 조직을 굴려 조직이 중간 목욕에 잠긴 채로 유지되도록합니다. 조심스럽게 동결 매체를 포함하는 포함 형질에 조직을 배치합니다.
해당 레이블 태그를 고정 매체 또는 몰드에 수직으로 배치하여 작성된 레이블이 매체 외부에 표시되도록 합니다. 동결 배지가 불투명하게 변하면, 금형에서 조직 블록을 제거하고, 조직 블록을 드라이 아이스에 배치하고 각 종양 섹션에 대해 동결을 반복한다. 극저온 절제 절차 전에 몇 달 동안 영하 80도의 티슈 블록을 저장합니다.
조직 블록의 슬라이드를 만든 후, 5 분 동안 영하 18도에서 95 %에탄올로 티슈 섹션 슬라이드를 수정합니다. 고정 된 섹션을 PBS로 5 분 동안 씻으시면됩니다. 단면의 크기에 따라 DAPI를 사용하여 수성 마운팅 배지의 10~50마이크로리터를 조직 섹션에 추가하고, 티슈 섹션 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다.
12~24시간 마운팅 후, 고정 종양 섹션의 관심 영역을 식별하고 이전에 설명한 바와 같이 형광 현미경검사를 사용하여 이미지를 습득한다. 인간 종양 세포 고정 및 DAPI와 함께 서 2~ 24 시간 후에, 에피소드 형광 화상 진찰 시스템 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 심상을 캡처합니다. 쌍안경 모드에서 직립 상피 현미경의 무대에 슬라이드를 배치합니다.
이미징 프로그램을 열고 10배 의 목표를 선택하고 스테이지를 조정하여 초점을 정의합니다. 슬라이드를 좌측에서 오른쪽으로 스캔하여 관심 영역을 식별합니다. 40배 의 목표를 선택하고 현미경의 토글을 사용하여 쌍안경에서 이미지 캡처 모드로 전환합니다.
라이브 품질 아이콘을 클릭하여 이미지를 보고 나중에 수집합니다. 획득 도구 모음의 OC 패널을 사용하여 각 필터 큐브 또는 형광 채널에 대한 노출 매개 변수를 정의한 다음 멀티 채널 수집 툴바를 사용하여 정의된 노출 설정으로 세 채널 이미지를 획득합니다. 또는 필터 큐브 사이를 전환하고, 노출 시간을 설정하고, 각 채널의 이미지 수집 사이의 셔터를 닫거나 열고, 개별 채널에 대해 촬영한 각 이미지를 오버레이하여 다중 채널 이미지를 수동으로 획득할 수 있습니다.
이미지를 nd2 파일로 저장합니다. 병합된 채널 이미지와 개별 채널 이미지를 포함하여 TIF 파일을 저장합니다. 주석 및 측정 툴바의 개체 수 기능을 사용하여 저장된 nd2 이미지 파일에 NHF-ATP, TMR 고분자중량 형광 드엑스트라및 TMR 저분자량 형광 드엑스트라 포지티브 셀의 수를 계산하고 분석 프로그램을 통해 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다.
이 프로토콜은 비수성 ATP의 세포 내산화의 공간, 시간적 및 정량적 분석을 위해 개발되었다. 비수성 형광 ATP의 세포 내산화는 체외, 전 생체 및 생체 내에서 높은 또는 저분자 량 형광 dextran을 가진 비가수분해성 형광 ATP의 공동국화에 의해 입증되었다. 종양 세포가 내재화된 ATP를 유지하도록 하기 위해 모든 종양 내 주입을 위한 제한된 실험 시간이 극저온-임베딩에 있습니다.
또한 종양 전체에 걸쳐 이미징 조직에 의한 종양 내 변이를 설명합니다. 향후 방법의 반복에는 E-ATP 내재화 프로세스의 실시간 시각화가 포함될 수 있으며, 특정 조직에서 거시노세포 역학 및 인신 매매에 대한 정보를 공개할 수 있습니다.
