Las células cancerosas tienen una notable capacidad para internalizar nutrientes, como el ATP, del entorno extracelular. Nuestro protocolo nos permite demostrar la internalización de ATP y visualizar la localización de ATP dentro de las células. Esta imagen de alta resolución de ATP internalizado, dentro de macropynozomes, es ideal para comprender la localización especial y completar la cantidad de análisis de internalización.

El protocolo describe diferentes aplicaciones experimentales para estudiar la internalización del ATP. Este método se puede utilizar para estudiar diferentes mecanismos de internalización celular, incluyendo la macropinocitosis y la endocitosis mediada por exosomas. Para las enfermedades metabólicas, la internalización de ATP en células no cancerosas se puede estudiar con este protocolo.

Para comenzar, sembra las células cancerosas en un matraz de 225 centímetros cuadrados, que contiene DMEM suplementado con FBS y antibióticos. Permita que las células crezcan a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en la incubadora de cultivo celular. Una vez que se logra el 80% de confluencia, separe las células y gleteen por las células de separación por centrifugación, y resuspenda las células en PBS helado para lograr la densidad celular de 5 veces 10 a las 6 células por cada 100 microlitros de PBS.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Limpie el sitio de inyección en el flanco de un ratón inmunodeficiente, con 75% de etanol, y limpie el exceso de etanol con una delicada limpieza de tareas. Extraiga las células en una jeringa sin látex de un mililitro, equipada con una aguja deslizante de precisión de calibre 27.

Para la inyección subcutánea, sostenga la aguja en un ángulo de aproximadamente 10 grados con respecto a la piel e inserte la punta de la aguja con el bisel hacia arriba debajo de la piel, manteniendo solo uno o dos milímetros de la aguja fuera de la piel. Dispense las células de la jeringa lentamente durante aproximadamente 10 segundos. Después de inyectar todo el volumen, mantenga la aguja en su lugar durante tres a cinco segundos y luego retire la aguja.

Aplique una presión suave pero firme en el lugar de la inyección durante tres a cinco segundos con los dedos, para evitar fugas del contenido inyectado. Monitoree y mida el crecimiento del tumor usando pinzas Vernier, hasta que los tumores alcancen un volumen de 200 a 500 milímetros cúbicos. Disuelva 300 microlitros de 16 miligramos por mililitro de dextrano fluorescente de alto peso molecular y DMEM sin suero, e incube en un baño de agua, templado a 37 grados Celsius durante 30 minutos, luego, centrifugue la solución de dextrano y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros.

A 40 microlitros, un análogo de ATP fluorescente no hidrolizable de un milimolar a 160 microlitros de DMEM sin suero, para hacer una solución de ATP fluorescente no hidrolizable de 0,2 milimolares. Preparar las soluciones de tratamiento de DMEM u ocho miligramos por mililitro de dextrano fluorescente de alto o bajo peso molecular, con o sin ATP fluorescente no hidrolizable micromolar de 100 en DMEM, mezclando las soluciones madre preparadas previamente. Use una jeringa de un mililitro para recolectar 50 microlitros de una solución de tratamiento.

Inyecte la solución directamente en el tumor de xenoinjerto y repita durante cuatro réplicas biológicas de cada tratamiento. Después de sacrificar al ratón y aislar el tejido tumoral, use una cuchara perforada para recoger el tejido tumoral resecado e inmediatamente coloque el tejido en un medio de congelación y enrolle el tejido, asegurándose de que el tejido permanezca sumergido en los baños medianos, todas las superficies del tejido. Coloque cuidadosamente el tejido en el molde de incrustación que contiene el medio de congelación.

Coloque la etiqueta de etiqueta correspondiente verticalmente en el medio de congelación o molde, asegurándose de que la etiqueta escrita sea visible fuera del medio. Cuando el medio de congelación se vuelva blanco opaco, retire el bloque de tejido del molde, coloque el bloque de tejido sobre hielo seco y repita la congelación para cada sección del tumor. Guarde los bloques de tejido a menos 80 grados centígrados durante varios meses antes del procedimiento de crioseccionación.

Después de hacer las diapositivas de los bloques de tejido, fije las diapositivas de la sección de tejido en etanol al 95% a menos 18 grados celsius durante cinco minutos. Lave la sección fija con PBS durante cinco minutos. Agregue de 10 a 50 microlitros de un medio de montaje acuoso con DAPI a las secciones de tejido, de acuerdo con el tamaño de las secciones, y coloque un resbalón de cubierta de vidrio sobre la sección de tejido.

Después de 12 a 24 horas de montaje, identifique las regiones de interés de las secciones tumorales fijas y adquiera las imágenes mediante microscopía de fluorescencia como se demostró anteriormente. Después de dos a 24 horas de la fijación de células tumorales humanas y de pie con DAPI, capture las imágenes utilizando un sistema de imágenes de epifluorescencia y un software de adquisición de datos. Coloque el portaobjetos en el escenario de un microscopio de epiflorescencia vertical en modo binocular.

Abra el programa de imágenes, seleccione el objetivo de 10 veces y ajuste el escenario para definir el enfoque. Escanee la diapositiva de izquierda a derecha de manera serpentina para identificar las regiones de interés. Seleccione el objetivo de 40 veces y use el interruptor del microscopio para cambiar del modo binocular al modo de captura de imágenes.

Haga clic en el icono de calidad en vivo para ver y posteriormente adquirir las imágenes. Utilice el panel OC de la barra de herramientas de adquisición para definir los parámetros de exposición para cada cubo de filtro o canal fluorescente, a continuación, utilice la barra de herramientas de adquisición multicanal para adquirir una imagen de tres canales con la configuración de exposición definida. Alternativamente, las imágenes multicanal se pueden adquirir manualmente alternando entre los cubos de filtro, estableciendo el tiempo de exposición, cerrando o abriendo el obturador entre la adquisición de imágenes para cada canal y superponiendo cada imagen tomada para canales individuales.

Guarde la imagen como archivo nd2. Guarde los archivos TIF, incluida la imagen de canal combinada y las imágenes de canal individuales. Utilice la función de recuento de objetos en la barra de herramientas de anotaciones y mediciones para contar el número de células positivas de DEXTRANO fluorescente de alto peso molecular DE NHF-ATP, TMR de alto peso molecular y dextrano fluorescente de bajo peso molecular TMR en un archivo de imagen nd2 guardado y exporte los datos a una hoja de cálculo a través del programa de análisis.

Este protocolo fue desarrollado para el análisis espacial, temporal y cuantitativo de la internalización celular de ATP no hidrolizable. La internalización intracelular de ATP fluorescente no hidrolizante se demostró mediante colocalización de ATP fluorescente no hidrolizable con dextrano fluorescente de alto o bajo peso molecular in vitro, ex vivo e in vivo. Para garantizar que las células tumorales retuvieran ATP internalizado, se limitó el tiempo experimental para toda la inyección intratumoral a la crioincrustación.

También tenga en cuenta la variación intratumoral mediante imágenes de tejido en todo el tumor. Las iteraciones futuras de nuestro método podrían implicar la visualización en tiempo real del proceso de internalización de E-ATP, revelando información sobre la cinética macroinocítica y el tráfico de tejidos específicos.