As células cancerígenas têm uma notável capacidade de internalizar nutrientes, como o ATP, do ambiente extracelular. Nosso protocolo nos permite demonstrar a internalização da ATP e visualizar a localização de ATP dentro das células. Esta imagem de alta resolução de ATP internalizada, dentro de macropirnozomes, é ideal para entender a localização especial e completar a quantidade de análise de internalização.
O protocolo descreve diferentes aplicações experimentais para estudar a internalização da ATP. Este método pode ser usado para estudar diferentes mecanismos de internalização celular, incluindo macropinocitose e endocitose mediada por exossomo. Para doenças metabólicas, a internalização da ATP em células não cancerígenas pode ser estudada com este protocolo.
Para começar, semear as células cancerígenas em um frasco de 225 centímetros quadrados, contendo DMEM suplementado com FBS e antibióticos. Permita que as células cresçam a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na incubadora de cultura celular. Uma vez alcançada a confluência de 80%, desprende as células e pelotas pelas células desprendidas por centrifugação, e resuspenja as células em PBS gelado para alcançar a densidade celular de 5 vezes 10 a 6 células por 100 microliters de PBS.
Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Limpe o local da injeção no flanco de um rato imunodeficente, com 75% de etanol, e limpe o excesso de etanol com uma delicada limpeza de tarefas. Desenhe as células em uma seringa sem látex de um mililitro, equipada com uma agulha de deslizamento de precisão de 27 calibres.
Para injeção subcutânea, segure a agulha em cerca de um ângulo de 10 graus para a pele e insira a ponta da agulha com o bisel voltado para baixo da pele, mantendo apenas um a dois milímetros da agulha fora da pele. Dispense as células da seringa lentamente durante aproximadamente 10 segundos. Depois de injetar todo o volume, segure a agulha no lugar por três a cinco segundos e, em seguida, retire a agulha.
Aplique pressão suave, mas firme no local da injeção por três a cinco segundos com os dedos, para evitar o vazamento do conteúdo injetado. Monitore e meça o crescimento do tumor usando pinças Vernier, até que os tumores atinjam um volume de 200 a 500 milímetros cúbicos. Dissolver 300 microlitres de 16 miligramas por mililitro de alto peso molecular fluorescente dextran e DMEM sem soro, e incubar em um banho de água, temperado a 37 graus Celsius por 30 minutos, então, centrifugar a solução dextran e transferir o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Com 40 microlitres, um estoque análogo ATP fluorescente não hidrolizante de um mililitro para 160 microliters de DMEM sem soro, para fazer uma solução ATP fluorescente não higrivelmente 0,2 milimililar. Prepare as soluções de tratamento de DMEM ou oito miligramas por dextran fluorescente de alto ou baixo peso molecular do mililitro, com ou sem 100 ATP fluorescentes não-higrivelmente 100 micromolar em DMEM, misturando as soluções de estoque preparadas anteriormente. Use uma seringa de um mililitro para coletar 50 microliters de uma solução de tratamento.
Injete a solução diretamente no tumor de xenoenxerto e repita para quatro réplicas biológicas de cada tratamento. Depois de eutanizar o camundongo e isolar o tecido tumoral, use uma colher perfurada para colher o tecido tumoral ressecado e coloque imediatamente o tecido em um meio de congelamento e role o tecido, garantindo que o tecido permaneça submerso nos banhos médios, todas as superfícies teciduais. Coloque cuidadosamente o tecido no molde de incorporação contendo o meio de congelamento.
Coloque a etiqueta correspondente verticalmente no meio ou molde de congelamento, garantindo que o rótulo escrito seja visível fora do meio. Quando o meio congelante ficar branco opaco, remova o bloco de tecido do molde, coloque o bloco tecidual no gelo seco e repita o congelamento para cada seção do tumor. Armazene os blocos de tecido a menos 80 graus Celsius por vários meses antes do procedimento de crioseção.
Depois de fazer as lâminas dos blocos teciduais, fixar a seção tecidual desliza em 95% de etanol a menos 18 graus Celsius por cinco minutos. Lave a seção fixa com PBS por cinco minutos. Adicione 10 a 50 microliters de um meio de montagem aquoso com DAPI às seções teciduais, de acordo com o tamanho das seções, e coloque uma tampa de vidro sobre a seção tecidual.
Após 12 a 24 horas de montagem, identifique regiões de interesse das seções fixas do tumor e adquira as imagens utilizando microscopia de fluorescência, como demonstrado anteriormente. Após duas a 24 horas da fixação celular do tumor humano e em pé com o DAPI, capture as imagens usando um sistema de imagem de epifluorescência e software de aquisição de dados. Coloque o slide no palco de um microscópio de epiflorescência vertical no modo binóculo.
Abra o programa de imagem, selecione o objetivo 10 vezes e ajuste o palco para definir o foco. Escaneie o slide da esquerda para a direita de forma serpentina para identificar as regiões de interesse. Selecione o objetivo de 40 vezes e use o alternador no microscópio para mudar do binóculo para o modo de captura de imagem.
Clique no ícone de qualidade ao vivo para visualizar e, posteriormente, adquirir as imagens. Use o painel OC na barra de ferramentas de aquisição para definir os parâmetros de exposição para cada cubo de filtro ou canal fluorescente, então, use a barra de ferramentas de aquisição multicanal para adquirir uma imagem de três canais com as configurações de exposição definidas. Alternativamente, imagens multicanais podem ser adquiridas manualmente, inclinando-se entre os cubos do filtro, definindo o tempo de exposição, fechando ou abrindo o obturador entre a aquisição de imagens para cada canal e sobrepondo cada imagem tirada para canais individuais.
Salve a imagem como arquivo ND2. Salve os arquivos TIF, incluindo a imagem do canal mesclado e imagens individuais do canal. Use o recurso de contagem de objetos nas anotações e barras de ferramentas de medição para contar o número de NHF-ATP, TMR de alto peso molecular fluorescente dextran e células fluorescentes de baixo peso molecular dextran em um arquivo de imagem nd2 salvo e exportar os dados para uma planilha através do programa de análise.
Este protocolo foi desenvolvido para análise espacial, temporal e quantitativa da internalização celular de ATP não higdrolyzável. A internalização intracelular de ATP fluorescente não higdrolyzável foi demonstrada pela colocalização de ATP fluorescente não-higdrolyzável com dextran fluorescente de alto ou baixo peso molecular in vitro, ex vivo e in vivo. Para garantir que as células tumorais retivessem o ATP internalizado, o tempo experimental limitado para toda a injeção intratumoral para a incorporação crio-inserida.
Também são contabilizadas a variação intratumoral por tecido de imagem em todo o tumor. Futuras iterações do nosso método podem envolver a visualização em tempo real do processo internalizador do E-ATP, revelando informações sobre cinética macropirocítica e tráfico de tecidos específicos.
