우리의 프로토콜은 ECM이 고전적인 반포성 중재자가 없는 상태에서 사이포겐성 분화를 촉진할 수 있으며 ECM에 의한 세포 대사의 질병 별 조절을 최초로 입증한다는 것을 보여줍니다. 우리의 기술은 지방 조직 대사에 ECM과 지방 세포의 역할을 해부하고 지방 조직 항상성을 조절하는 ECM의 역할에 대한 연구를 허용하는 도구를 제공합니다. 표준 2D 세포 배양과 비교하여, 우리의 3D 모형은 타입-2 당뇨병의 맥락에서 지방 조직 ECM 사이 단화제의 더 강력한 검사 그리고 해부를 허용합니다.
더 작은 샘플부터 세포화정도를 측정하는 것이 좋습니다. 세포가 얼마나 잘 성장하고 조직이 얼마나 잘 탈세포화에 입원 환자 간 가변성이 있다는 것을 명심하십시오. 조직이 세포탈화되고 있는지 확인하고 샘플 사이의 잠재적 인 차이를 이해하기 위해 각 단계 전후의 조직을 관찰하는 것이 중요합니다.
수술에서 내장 지방 조직 또는 부가가치세를 얻은 후 50 밀리리터 원추형 튜브에 5-10 그램의 조직을 동결 완충액에 추가하여 저장을 준비하십시오. 완전히 샘플을 담그고 탈세포화 될 때까지 영하 80도에서 저장하십시오. 지방 세포 절연을 위해, 콜라게나아제 타입 II 용액의 20 밀리리터에 그대로 부가가치세의 신선한 샘플 2 그램을 배치한 다음, 멸균 가위를 튜브에 삽입하고 조직을 철저히 다진다.
일단 훌륭한 슬러리에 다진 후, 60 분 동안 궤도 셰이커에 섭씨 37도에서 콜라게나제 용액에 인큐베이션. 인큐베이션 후, 100 마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 소화된 결과체를 신선한 50밀리리터 원뿔튜브로 필터링합니다. 소화는 적당한 점도와 소화되지 않은 조직의 소량의 잔류 가닥을 가진 황색 오렌지 액체여야 합니다.
원심 분리시 샘플을 10 분 동안 270 배 g에서 제거하고, 상류체를 제거하고 파이펫으로 1X RBC 용액의 2 밀리리터에서 셀 펠릿을 재연합니다. 25도에서 1분 동안 솔루션을 배양한 다음 15%의 FBS DMEM F12의 10밀리리터를 추가하고 원심분리기를 10분 동안 270배 g로 추가합니다. ECM을 준비하려면 이전에 냉동 된 VAT 샘플을 섭씨 37도로 동결 / 해동하여 주기적 부드러운 수동 교반으로 20 분 동안 예열 된 수조에서 배양하십시오.
일단 해동되면, 20 분 동안 다시 영하 80도까지 조직을 전송하고 해동으로 끝나는 동결 / 해동 과정을 세 번 반복합니다. 멸균 집게를 사용하여 부가가치세 샘플을 15-25 밀리리터의 효소 용액 1을 포함하는 신선한 50 밀리리터 원추형 튜브로 전송하여 샘플이 완전히 침지되도록 하십시오. 그런 다음 130 RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양하십시오.
다음 날, 헹구는 완충액15-25 밀리리터로 샘플을 세 번 세척하고 세척 후 용액을 부어 주세요. 샘플을 15-25 밀리리터의 효소 용액 2로 신선한 50 밀리리터 튜브로 옮기고 하룻밤 동안 배양합니다. 헹폐용 용액으로 세초를 반복하고 샘플을 극성 용매 추출 용액15-25 밀리리터를 포함하는 신선한 튜브로 전송합니다.
흔들리는 동안 하룻밤 동안 샘플을 배양. 극성 용매 용액을 사용하여 배양 후 지질 제거를 위한 샘플을 검사하는 것이 중요합니다. 지질의 대부분이 제거되지 않는 경우, 이 단계를 반복할 필요가 있을 수 있습니다.
잠복기 시간이 짧을수록 사용될 수 있다. 인큐베이션 후, 헹굴 버퍼 용액의 15-25 밀리리터를 포함하는 신선한 튜브로 샘플을 전송하고 셰이커에 샘플을 세 번 세척한다. 그런 다음 70% 에탄올 용액으로 샘플을 세 번 세척하고 세척 후 에탄올을 부어 주세요.
수납 용액으로 샘플을 한 번 세척한 다음 멸균 집게를 사용하여 15-25 밀리리터의 저장 솔루션이 들어있는 신선한 튜브로 전달하여 완전히 침지하십시오. 그런 다음 샘플은 최대 한 달 동안 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다. 이소프로판올과 에탄올은 인화성이며 실온에 있어야 하며 인화성 폐기물로 폐기되어야 합니다.
인간의 폐기물은 일반적인 생물학적 위험 폐기물과 별도로 폐기되어야 합니다. 저장된 ECM 조각을 계획된 다운스트림 에세이에 필요한 만큼 의기식 집게를 추가하여 멸균 집게를 사용하여 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮습니다. 궤도 셰이커에 70%에탄올의 500 마이크로리터로 세 번 씻은 다음 PBS로 세 번 세척하여 수분을 보충합니다.
멸균 가위를 사용하여 ECM을 100 밀리그램 조각으로 자른다. 각 조각을 24웰 플레이트의 한 우물에 넣고 접시를 섭씨 25도에서 15분 동안 배양하여 초과 PBS가 조각에서 돌출되도록 합니다. 그런 다음 파이펫으로 우물에서 남은 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
세포를 ECM으로 직접 피펫하여 20마이크로리터의 프리디포사이클 세포 현탁액을 가진 각 단편을 시드한다. 파이펫 팁을 ECM에 넣고 매트릭스의 중앙으로 부드럽게 추방하여 셀 서스펜션이 오버플로되지 않고 우물 의 바닥에 끝납니다. 셀 서스펜션이 ECM에서 오버플로되는 경우 해당 위치에서 파이펫 팁을 제거하고 ECM의 다른 곳에 삽입합니다.
세포 파종 후, 섭씨 37도에서 40 분 동안 ECM을 배양하십시오. 종자 ECM 조각을 커버하기 위해 성장 매체의 500 마이크로 리터로 각 우물을 채웁니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 72시간 동안 배양합니다.
72시간 후, ECM 단편을 방해하지 않고 성장 매체를 조심스럽게 흡인시합니다. 분화 매체의 마이크로리터 500개를 추가하고 2~3일마다 미디어를 14일 동안 배양한다. 가벼운 현미경 검사를 사용하여 차별화를 확인합니다.
세포는 지질을 축적하고 갈색 - 노란색을 색상으로 바꾸고 분화할 때 더 구형이됩니다. 지방 조직 ECM의 준비, preadipocytes로 시드, 성숙한 지방세포로 체외 분화는 ECM의 탈세포화 및 재종 및 분화 시 지방을 포함하는 지질의 후속 회수를 밝혀 스캔 전자 현미경 검사로 모니터링되었다. 콜라겐 1 특이적 면역조직화학은 콜라겐 마이크로 아키텍처의 유지보수를 보였으며, 오일 레드-O 염색은 살아있는 및 고정된 3D ECM-아디포사이클스 구조의 지질을 나타내고 지방세포가 함유되어 있었다.
ECM에서 분화된 아디포세포는 이러한 유전자가 ECM에서 배양된 미분화 된 프리디포사이클에 비해 분화 된 세포에서 강화된다는 것을 입증한 정량적 실시간 PCR을 사용하여 아디포겐 성 유전자를 선별하였다. 성적 증명서 수준의 전체 차이점이 표시됩니다. 당뇨병 과 비 당뇨병 과목에서 ECM과 지방 세포의 네 가지 조합은 대사 phenotyping을 실시하였다.
lipolytic 기능에 있는 손상한 포도당 upup는 당뇨병 조직에서 구조물에서 발견되었습니다. 중요한 것은, 비당뇨병 ECM이 당뇨병 성 지방 세포에서 인슐린 자극 포도당 섭취및 lipolytic 용량을 구출한다는 것을 발견했습니다. 분리된 지방세포의 오염, 탈세포화된 조직 및 재시드 ECM은 드물지 않다.
불임은 프로토콜 전체에 걸쳐 부지런히 유지되어야 합니다.
