여분의 세포 소포의 저장 안정성은 그들의 미래 치료 사용에 대 한 중요 한 매개 변수. 당사의 프로토콜은 스토리지가 소포에 미치는 영향을 평가하기 위한 쉽게 적용할 수 있는 도구를 제공합니다. 우리의 기술의 주요 장점은 외인성 마커로 글루쿠로니다아제를 도입함으로써, 다른 부모 세포에서 파생된 세포외 소포는 그들의 질성에 관하여 쉽게 비교될 수 있다는 것입니다.
비대칭 유동장 유량 분획 또는 AF4는 매우 민감한 화합물에 대한 크기 배제 크로마토그래피 정제에 대한 가벼운 대안입니다. 화합물채널에서 덜 순수한 스트레스를 발생하기 때문입니다. 글루쿠로니다제는 민감한 효소이기 때문에, 상주하는 것의 질은 철저한 계획과 다시 다시 정제 및 분석을 위한 단계를 수행하여 유익합니다.
그 세포에 대한 표준 조건에 따라 관심의 세포주를 배양 한 후, 혈청 무료 또는 여분의 세포 소포 고갈 매체로 상체를 교체하고 추가 24 ~ 72 시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 세포를 반환합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 플라스크에서 슈퍼 나탄을 수집하고 세포를 퇴적시시 샘플을 원심 분리. 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 세포 조절 배지를 수집합니다.
그리고 매체를 원심분리하여 세포 이물질과 큰 골재를 제거합니다. 그런 다음 슈퍼네티를 조심스럽게 초원심분리기 튜브로 옮기습니다. 고정 각도 로터를 사용하는 경우 원심분리기의 튜브 방향을 표시하여 원심분리 후 세포외 소포 펠릿의 검색을 용이하게 합니다.
초원심분리가 끝나면 세포외 소포 펠릿을 방해하지 않고 상체 피펫을 조심스럽게 폐기하십시오. 0.2 마이크로미터 의 200 마이크로리터에서 PBS를 최초의 초원심분리기 튜브의 잔류 상류체로 여과하였다. 펠릿을 다시 중단한 후, 세포외 소포 펠릿의 모든 재중단될 때까지 후속 펠릿의 재서스펜션을 위해 결과 세포외 소포 현탁액을 다음 튜브로 옮기다.
최종 재중단 펠릿 용액에 베타 글루쿠로니다아제를 첨가하여 밀리리터당 1.5밀리그램의 최종 농도를 제공합니다. 그리고 수타포닌의 최종 농도0.1 밀리 리터 당 밀리 그램. 그런 다음 3 초 동안 소용돌이에 의해 잘 섞고 간헐적으로 부드러운 플릭으로 10 분 동안 실온에서 반응을 놓습니다.
글루쿠로니다아제가 캡슐화되면, 편견없는 저장 안정성 결과를 얻기 위해 같은 날 에 모든 후속 정화 소포 평가 단계를 수행해야합니다. 사포닌 인큐베이션 직후 펠릿을 정화할 준비가 된 PBS의 적어도 두 개의 컬럼 볼륨으로 평형된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 갖습니다. 정화하려면 최대 400마이크로리터의 세포외 소포 현탁액을 컬럼에 추가합니다.
그런 다음 용액의 밀리리터 분획 1개를 수집합니다. 오염 단백질과 무료 글루쿠로니다제로부터 세포외 소포의 분리를 준수하기 위해 제조업체지침에 따라 bicinchoninicacid 산 분석에 의한 단백질 농도를 측정합니다. 각 계측기 및 소포 유형에 최적화된 파라미터를 사용하여 나노 입자 추적 분석 기기를 사용하여 세포외 소포 크기와 농도를 측정합니다.
글루쿠로니다제 활성을 측정하려면, 정제된 세포외 소포의 125 마이크로리터에 갓 준비된 형광제 디베타-D-글루쿠로니드 25마이크로리터를 추가하고 검정96웰 플레이트의 한 웰에 샘플을 추가한다. 480 나노미터 발산 및 516 나노미터 방출에서 플레이트 판독기에서 시간 제로 형광 생산을 측정합니다. 증발을 줄이기 위해 투명 플라스틱 호일로 접시를 단단히 덮습니다.
그런 다음 37섭씨에서 18시간 동안 빛으로부터 보호된 판을 배양합니다. 방금 입증된 것처럼 플레이트 판독기에서 18시간 형광 생산을 측정합니다. 세포 외 소포 리오필화를 위해, 정제 된 소포에 트레할로스의 밀리리터 당 4 밀리그램을 추가하십시오.
그리고 소포를 영하 80도에서 적어도 한 시간 동안 얼어 붙입니다. 샘플을 lyophilize하려면, 15 섭씨와 0.180 밀리바에 압력으로 lyophilizer의 선반 온도를 설정합니다. 46 시간 동안 이러한 조건에서 소포를 건조.
주요 건조 단계의 끝에서 선반 온도를 섭씨 25도로 설정하고 압력은 0035 밀리바로 설정하고 이러한 조건에서 2 시간 동안 샘플을 건조시. 그런 다음 lyophilized 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. 저장 후 시료를 재수화하려면, lyophilization 전에 세포외 소포 현탁액의 부피와 동일한 양의 물을 추가한다.
저장 후 효소 활성을 평가하기 위해, 모바일 상에 대해 0.1 마이크로미터 필터링 된 PBS를 새로 준비한 AF4 계측기를 적재하고 펌프 후 피크 입구 필터에 0.1 마이크로미터 필터 멤브레인을 삽입하여 용매에서 입자 소음을 줄입니다. 분해 후, 밀에크 물로 AF4의 작은 채널을 청소하십시오. 30킬로달톤의 분자량이 잘린 새로운 재생셀룰로오스 멤브레인을 수분화하고 반짝이는 면을 가진 프렛 위에 멤브레인을 놓습니다.
폭 350 마이크로미터 스페이서를 채널의 상단 절반 아래에 놓고 채널 부품을 조립합니다. 토크 드라이버를 사용하여 먼저 나사를 5 뉴턴 미터의 토크로 조인 다음 7 뉴턴 미터의 토크로 조입니다. 십자적 패턴으로 블록 주위의 나사를 조입니다.
채널 입구, 콘센트 및 교차 흐름 포트를 일식에 연결합니다. 그런 다음 적어도 세 개의 오래된 샘플에서 멤브레인을 평형화합니다. 분당 1밀리리터로 설정된 검출기 흐름 및 초점 흐름과 분당 0.2 밀리리터의 주입 흐름으로 분획을 프로그래밍합니다.
1분 전 초점 단계 후, 10분 동안 샘플을 주입하고 스텝을 주입한 후, 8분 동안 분당 2밀리리터에서 분당 0.1 밀리리터로 크로스 흐름을 감소시다. 10분 동안 교차 흐름 없이 용출 단계로 분획 을 완료하고 용출 및 주입의 세척 단계를 추가한 다음 용출을 합니다. 그런 다음 분당 2 밀리리터의 초기 교차 흐름으로 다음 실행을 위한 채널을 상화하고 UV 검출기를 280 나노미터로 설정합니다.
모든 프로그램이 설정된 경우 300마이크로리터의 샘플을 주입하고 ASTRA 소프트웨어에서 UV 및 광 산란 신호를 기록합니다. 후 12 그리고 반 분, 때까지 1 밀리 리터 분획 수집 시작 27 분 사후 주입. 그런 다음 입증된 바와 같이 글루큐로니다제 분석 및 나노 입자 추적 분석을 수행한다.
여기서, 상이한 조건하에서 7일간의 저장 후 인간 혈관 내피 세포로부터 분리된 세포 외 소포의 입자 회수 및 크기는 신선한 샘플과 비교하여 도시된다. 소포는 이후에 AF4 정제를 실시하였고 입자당 글루쿠로니다제 활성을 측정하였다. 두 크기 제외 크로마토그래피와 AF4모두 세포외 소포를 무료 글루쿠로니다제에서 분리하는 데 성공합니다.
입자와 자유 효소 사이의 AF4에 대한 분리의 높은 정도로 인해, 소포를 포함하는 분수의 오염은 덜 가능성이 있다. 저장 후 AF4 정제는 샘플에서 무료 효소를 제거하고 따라서 입자 당 회수 효소 활성의 양을 낮춥다. 이 효과는 섭씨 4도에서 보관 한 후 가장 두드러지며 2/3 감소가 관찰됩니다.
이 추가 정화 단계를 생략하면 효소 안정성에 대한 잘못된 가정으로 이어질 수 있습니다. 전염 전자 현미경 검사는 극저온 보호제없이 lyophilized 세포 외 소포에 대한 모양의 큰 차이를 공개하지 않습니다. 그러나 전자 현미경 이미징을 스캔하면 영하 80도 저장된 샘플에서 발견되지 않는 lyophilized 샘플 내에서 골재의 존재를 알 수 있습니다.
글루쿠로니다제 분석 전에 무료 효소를 소포에서 제거하는 것이 중요합니다. 따라서, 소포 정제에 사용되는 기술은 철저히 평가될 필요가 있다. 정제된 입자는 또한 저장이 막 단백질 또는 설탕의 자연적인 조성을 바꾸었는지 알아내기 위하여 그들의 표면 전하의 관점에서 볼 수 있었습니다.
우리의 기술을 사용하면 사용 가능한 활동에 대한 알려진 특정 마커 또는 삽이 없는 경우에도 세포 외 소포 저장 안정성에 대한 첫 번째 표시를 얻을 수 있습니다.
