절차를 시연하는 것은 대학원생 Zhe Zhang, 연구 전문가 난난 장, 교수 일커 오즈덴과 싱화 딩입니다. 이 절차의 전반적인 목표는 유전으로 인코딩된 칼슘 표시기, GCaMP5G 및 6s를 사용하여 생체 내 및 생체 내 미토콘드리아 수에 대한 세포 유형 특정 쌍 성상세포 및 뉴런 및 미토콘드리아 표적 화 방법을 개발하는 것입니다. 시험관 내 또는 생체 내 이미징의 경우, 우리는 성상 세포 또는 뉴런 특정 프로모터 gfaABC1D 또는 CaMKII및 유전자 로코딩 된 칼슘 지표, 미토콘드리아 표적 화 시퀀스를 포함하는 DNA 플라스미드를 생성할 것입니다.
체외 미토콘드리아 칼슘 이미징의 경우 Lipofectamine 방법을 사용하여 전술한 DNA 플라스미드를 사용하여 유리 커버 슬립에서 배양된 성상세포 뉴런을 감염시켰습니다. 이미징은 유리 커버 전표를 상피 또는 2광자 현미경하에서 증혈 챔버로 이송하여 트랜스퍼빙 후 1~2일 후에 시작할 수 있다. 다음은 미토콘드리아와 왼쪽에 GCaMP6s를 발현하는 성상세포의 항성세포, 그리고 뉴런의 미토콘드리아의 경우 오른쪽에 GCaMP5G를 발현하는 예입니다.
생체 내 이미징의 경우, 우리는 성상세포에서 미토-GCaMP5G의 발현을 위한 혈청형 5 관련 아데노바이러스를 제조하고 혈중 에서 미토-GCaMP6s의 발현을 위한 혈청형 9 관련 아데노바이러스를 제조하였다. 스테레오탁스 바이러스 주입 수술의 경우, 마우스를 3%이소플루란으로 먼저 마취시켰습니다. 수술 후, 이소플루란 수준은 마취의 적절한 수준에 도달 한 후 2 %로 감소, 두피에 머리가 면도하고 마우스는 스테레오 탁스 수술 기구에 배치된다.
안과 연고는 수술 중 그들을 보호하기 위해 눈에 적용됩니다. 주사 수술은 멸균 기구 및 무균 기술을 포함하여 무균 절차를 사용하여 수행됩니다. 수술 기구는 오토클레이브 또는 뜨거운 비드 멸균기에 의해 멸균됩니다.
마우스를 스테레오탁에 장착한 후, 두피는 베타딘과 70%에탄올로 3번 세척됩니다. 그런 다음 브레그마 람다 축을 따라 피부가 열리고 수직은 대상 위치를 통해 고속 드릴로 만들어집니다. 이 작품에서, 우리는 모터 피질 또는 파라피질을 표적으로 했습니다.
연관된 아데노바이러스 벡터를 운반하는 33 게이지 해밀턴 주사기는 뇌내의 구멍을 통해 삽입되고 벡터는 대상 부위에 주입된다. 피질 전달을 위해 여러 단계에서 두 개의 깊이에서 바이러스 솔루션을 주입합니다. 첫째, 우리는 바늘을 피질 깊숙이 1밀리미터 삽입합니다.
뇌가 회복할 수 있도록 5분 후, 바늘을 최대 700마이크로미터 깊이로 이동하고 500나노 리터의 바이러스 용액을 주입합니다. 주사가 완료 된 후, 우리는 바이러스가 뇌에서 확산 될 수 있도록 5 분 동안 기다립니다. 그리고 우리는 300 마이크로 미터 깊이에서 두 번째 주입 위치로 바늘을 이동합니다.
여기에서, 우리는 바이러스 용액의 또 다른 500 나노 리터를 주입합니다. 주사가 완료 된 후, 우리는 바이러스가 확산 될 수 있도록 10 분 동안 기다린 다음 뇌에서 바늘을 제거하고 뼈 왁스 또는 Kwik-Sil로 버 구멍을 닫습니다. 마지막으로, 피부는 Vetbond로 봉합되고 마우스는 동물 시설로 다시 보내지기 전에 가열 패드에서 회복됩니다.
마우스는 GCaMP 발현이 성숙한 기간인 최소 3주 내에 생체 내 이미징에 사용할 준비가 되어 있습니다. 두개골 창 이식 수술은 또한 주사 수술에 대해 설명된 바와 같이 무균 조건을 사용하여 수행됩니다. 두개골 창 외과 적 절차는 두개골 노출 시점까지 주사 수술 절차와 동일합니다.
두개골이 노출되면 바이러스 주입 부위에 2-3mm 직경의 두개골 절제술이 조작기에 부착 된 고속 드릴에 의해 만들어진 4 개의 얕은 구멍으로 표시됩니다. 그런 다음 두개골의 단면, 두개골 절제술의 협곡에서 조심스럽게 천천히 이 네 개의 구멍을 연결하여 원주위의 뼈를 드릴링하여 얇게 합니다. 국경의 두개골이 충분히 얇으면 뼈가 날카로운 핀셋으로 들어 올려 제거됩니다.
노출된 듀라 마터는 두개골 창의 이식을 위해 제거하거나 그대로 보관할 수 있습니다. 우리의 두개골 창은 직경 3-5 밀리미터의 유리 커버 슬립으로 구성되어 있으며 중앙에 약 300 미크론 두께의 실리콘 디스크를 만듭니다. 두개골 창의 장착은 두개골 절제술 위에 배치하여 수행됩니다.
조작기에 부착 된 이쑤시개 조각은 두개골 창을 뇌 표면으로 부드럽게 밀어 붙이는 데 사용됩니다. 그런 다음 두개골 창의 가장자리는 소량의 실리콘 접착형 Kwik-Sil으로 밀봉됩니다. 마지막으로 두개골 창은 두개골 가장자리에 치과 아크릴이 고정되어 있습니다.
강한 결합을 위해 두개골 창의 가장자리에 약간 치과 아크릴을 적용하는 데 주의를 기울여야합니다. 과거에 많은 다른 연구 그룹이 구현한 바와 같이, 1.2%의 아가로즈 젤은 실리콘 디스크의 대안으로 커버 글래스와 뇌 간에 사용될 수 있다. 두개골 창을 단단히 설치하면 두개골에 금속 판이 부착됩니다.
이 헤드 플레이트는 이미징 세션 동안 2광자 현미경의 단계에서 마우스의 머리를 고정하는 데 사용됩니다. 성상세포에서미토콘드리아 칼슘 섭취는 ATD 적용에 의해 유도될 수 있으며, 뉴런의 미토콘드리아 칼슘 섭취는 관혈 시스템을 통해 중력으로 인공 뇌척수액의 글루타민리 글리신 적용에 의해 유도될 수 있다. 성상 세포와 뉴런의 개별 미토콘드리아에서 칼슘 섭취를 관찰 할 수 있습니다.
다음 영화는 왼쪽에 ATP에 의해 유도 된 성상세포에서 미토콘드리아 칼슘 섭취를 보여 주며 오른쪽에 글루타민트와 글리신에 의해 유도 된 뉴런. 이미징은 Coherent에서 백만 티 사파이어 울트라 1 레이저를 장착 프레리 테크놀로지스의 울티마 2 광자 현미경 시스템을 가진 성상세포 및 뉴런에서 미토콘드리아 형광 신호의 생체 내 2 광자 이미지를 수집하여 수행됩니다. 우리는 GCaMP5G 및 6s를 가진 생체 내 화상 진찰에 최적인 880 에서 910 나노미터의 흥분 파장을 이용합니다.
미토-GCaMP5G 및 6s의 성상세포 및 뉴런 특이적 발현 및 SR101 또는 뉴런 특이적 마커 NeuN의 성상세포 특이적 라벨링의 공동 국소화에 의해 재확인된다. 생체 내 성상 세포와 뉴런의 자발적인 미토콘드리아 칼슘 섭취는 2광자 현미경 검사를 사용하여 시간 경과 이미징에 의해 관찰될 수 있다. 이미지는 왼쪽에 있는 성상세포에 있는 개별 미토콘드리아에 있는 개별적인 칼슘 증가 및 오른쪽에 있는 신경을 보여줍니다.
우리의 접근은 체외 및 생체 내의 세포 모형 특정 미토콘드리아 칼슘 화상 진찰에 유용합니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 성상 세포와 뉴런에서 미토콘드리아 칼슘 섭취를 이미지하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
