이 기술은 뉴런의 칼슘 처리에 대한 우리의 이해와 구획화된 칼슘이 생체 내에서 뉴런 기능에 중요한 다양한 메커니즘을 조절할 수 있는 방법을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 형광 도구와 결합할 수 있는 예쁜꼬마선충의 생리학적 조건에서 더 높은 해상도의 빠른 생체 내 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 기술은 다양한 맥락에서 뉴런의 칼슘 신호 전달을 조절하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
예를 들어, 노화, 신경 손상 및 신경 퇴행 중. 이 절차를 시연하는 것은 연구 기술자인 Ennis Deihl이 될 것입니다. Kaz Knight, PhD 후보자, Rachel Doser, 내 연구실의 박사후 연구원.
프로모터, 칼슘 지표 및 선택된 3개의 프라임 UTR을 포함하는 발현 벡터를 클로닝하는 것으로 시작합니다. 칼슘 지표 이식유전자에 구조 DNA Lin-15 plus를 포함하는 DNA 혼합물을 생후 1일 된 성인 C.elegans의 생식선에 미세주입하여 형질전환 예쁜꼬마선충 균주를 만듭니다. F1 자손이 성체가 될 때까지 주입된 부모 벌레를 섭씨 20도로 유지하십시오.
다중 외음부 표현형의 부재를 스크리닝하여 형질전환 성인을 선택합니다. 이는 칼슘 지시약을 포함하는 여분의 염색체 배열의 발현을 나타낸다. 다외음부 표현형을 갖지 않는 클론 계대 성인 F1 자손.
칼슘 지표의 최적 발현으로 형질전환 균주의 후속 세대에 대한 실험을 수행합니다. 장기간 타임랩스 이미징이 가능한 현미경을 사용하십시오. 저배율 대물렌즈 아래에서 웜을 찾은 다음 고배율 대물렌즈로 전환하여 뉴런의 위치를 파악합니다.
50FPS 이상의 빠른 이미지 획득이 가능한 초고감도 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다. 다음으로 칼슘 표시기에 표준 배출 필터를 사용하십시오. 10초보다 긴 이미지 스트림을 획득하기 위해 Z-드리프트 보정기를 추가합니다.
13 x 100mm 유리 배양 튜브에서 분자 등급 한천을 M9에 용해시켜 10% 한천 3밀리리터를 준비하고 전자레인지에 몇 초 동안 돌립니다. 한천 패드를 만들려면 먼저 두 겹의 실험실 테이프를 추가하여 두 개의 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 두 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 놓습니다.
1000마이크로리터 피펫 팁의 끝을 자르고 이를 사용하여 커버 슬립 중앙에 작은 한천 방울을 피펫팅합니다. 한천 위에 다른 슬라이드를 눌러 한천을 평평하게 합니다. 냉각 후, 10 밀리리터 튜브의 개구부를 사용하여 한천을 작은 디스크로 자른 다음 주위의 한천을 제거하십시오.
다음으로, muscimol 분말을 M9에 용해시켜 웜 롤링 용액을 준비하여 30 밀리몰 스톡을 만듭니다. 스톡을 폴리스티렌 비드로 일대일 비율로 희석하여 압연 용액을 만듭니다. 이미징을 위해 웜을 배치하려면 먼저 1.6마이크로리터의 롤링 용액을 한천 패드 중앙에 놓습니다.
그런 다음 선호하는 웜 픽을 사용하여 원하는 나이의 웜을 한천 패드의 롤링 용액으로 옮깁니다. muscimol이 웜 움직임을 줄일 때까지 약 5분 동안 기다린 다음 한천 패드 위에 22 x 22mm 커버 슬립을 떨어뜨립니다. 복부 신경줄의 신경돌기를 영상화하려면 커버 슬립을 살짝 밀어 벌레를 굴립니다.
현미경에 웜을 장착하려면 커버 슬립에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 명시야에서 저배율 대물렌즈를 사용하여 웜을 찾습니다. 그런 다음 100x 대물렌즈로 전환하고 488나노미터 이미징 레이저로 GCaMP 또는 mito GCaMP의 조명을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾습니다.
생체 내 GCaMP 이미징의 경우 바질 GCaMP 형광이 카메라 다이내믹 레인지의 중간 범위에 있을 때까지 획득 설정에서 이미징 레이저를 조정하고 노출 시간을 20밀리초로 설정합니다. 100배 배율에서 GCaMP 형광을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾은 후 Z-드리프트 교정기를 설정하고 연속 자동 초점을 시작합니다. 이미징하기 전에 필요에 따라 초점면을 수동으로 수정하십시오.
100배 배율로 이미지 스트림을 획득합니다. 이 프로토콜을 사용하여 세포질 칼슘을 높은 시간 및 공간 분해능으로 측정했습니다. 글루타메이트성 AVA 명령 중간 뉴런에서 GCaMP6F의 세포 특이적 발현은 칼슘 유입의 방향성 전파를 밝혀냈습니다.
GCaMP6F 형광의 세포 내 정량화는 칼슘 유입의 시작이 불과 10마이크로미터 떨어진 신경돌기의 일부에서 지연된다는 것을 보여주었습니다. 또한, AVA 신경돌기를 따라 발견된 수지상 척추 유사 구조는 신경돌기 활성화와 독립적으로 발생하고 칼슘 유입의 전파로 이어지지 않는 GCaMP6F 형광에서 섬광을 보였습니다. 또한, 상대적 칼슘 수준은 미토콘드리아 기질의 AVA 특이적 발현을 갖는 웜 균주를 사용하여 단일 신경돌기에서 개별 미토콘드리아에서 미토콘드리아 칼슘 지표 GCaMP를 측정하였다.
결과는 상대적으로 많은 양의 칼슘이 미토콘드리아의 하위 집합으로 동시에 흡수되는 것을 보여주었습니다. 특히, 일부 미토콘드리아로의 칼슘 흡수는 동기화된 반면, 인접한 미토콘드리아는 칼슘을 흡수하지 않는 것으로 나타났습니다. 유사하게, 미토콘드리아의 하위 집합은 소량의 칼슘의 빠른 흡수와 방출을 보여주었습니다.
이것은 또한 동기적인 것으로 보였지만 미토콘드리아의 하위 집합에 대해서만 나타났습니다. 속도와 미세한 조작은 동물의 위치를 지정하고 신경 기능을 유지하는 데 필수적입니다. 동물의 건강도 가장 중요합니다.
조금이라도 굶주림이 문제가됩니다. 가장 배우기 어려운 부분은 손상 없이 컨포칼 현미경 검사를 위한 동물의 빠른 방향입니다. 내 조언은 많은 연습과 좋은 컨트롤입니다.
이 프로토콜은 칼슘이 뉴런, 다른 뉴런 또는 예쁜꼬마선충의 뉴런 이외의 다른 세포 내 위치에서 방출되는 실험에 적용될 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 이러한 접근 방식은 동물을 온전하게 남겨두기 때문에 완전한 신경계의 단일 뉴런에서 생체 내 세포내 칼슘 처리 조절에 대한 질문을 해결할 수 있습니다.
