미토콘드리아 대사는 T 세포 내구성과 기억의 필수 조절자입니다. 따라서 미토콘드리아 호흡을 측정하는 것은 T 세포의 특성에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. Seahorse 기계는 라벨링이 필요없이 살아있는 인간 일차 T 림프구에서 실시간으로 미토콘드리아 호흡의 다양한 요소를 측정 할 수 있습니다.
이 방법은 암 면역 요법 성공의 중요한 예측 인자 인 T 세포 적합성 및 기억 잠재력을 모니터링하는 데 매우 적합합니다. 시작하기 위해, 백만 세포 당 12.5 마이크로리터의 비드를 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 튜브 내의 비드 12.5 마이크로리터 당 12.5 마이크로리터의 PBS를 첨가함으로써 CD3/CD28 비드를 세척한다. 이어서, 마이크로원심분리 튜브를 적합한 자석 상에 일분 동안 놓고, 완충제를 버리고, 비드를 원래 부피의 T 세포 배지에 재현탁시킨다.
다음으로, 백만 세포 당 12.5 마이크로 리터의 비드를 1 ~ 두 개의 비드 대 세포 비율로 첨가하고, 세포를 각각 약 5 백만 개의 세포가있는 두 가지 조건으로 나눕니다. 이어서, 정확한 부피의 사이토카인을 각 조건에 첨가하고, 세포를 다중 웰 플레이트로 옮긴다. 세포를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 3 일 동안 배양하십시오.
사흘간의 배양 후, 사이토카인의 두 배 농도로 신선한 T 세포 배지를 준비한다. 세포를 재현탁시키고 각 웰에서 부피의 절반을 새로운 웰로 옮겨 세포를 분할한다. 이어서, 동일한 부피의 갓 준비된 T 세포 배지를 각 웰에 첨가한다.
세포외 플럭스 분석을 위해, 중탄산나트륨, Cell-Tak, 및 수산화나트륨을 함유하는 코팅 용액을 준비한다. 그런 다음 신선한 XF 세포 배양 플레이트를 열고 새로 준비된 코팅 용액 12 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하여 모든 웰의 바닥에 코팅 용액의 균일 한 분포를 보장합니다. 플레이트를 뚜껑을 켠 상태에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 모든 웰에서 남아있는 액체 용액을 버리십시오. 플레이트를 200 마이크로 리터의 멸균수로 씻고 액체를 버리십시오. 다음에, 플레이트를 200 마이크로리터의 세포 배양 등급 멸균 PBS로 세척한다.
액체를 버린 후 플레이트를 실온에서 30 분 동안 건조시킵니다. T 세포를 XF 세포 배양 플레이트에 플레이트하기 위해, 실험 설정에 따라 적합한 XF RPMI 배지와 글루코스, 피루베이트 및 글루타민을 혼합함으로써 50 밀리리터의 분석 배지를 제조하였다. 제조된 배지를 이산화탄소 조절되지 않은 인큐베이터에서 섭씨 37도로 가열하고, pH를 7.4로 설정하였다.
세포를 심고 올리고마이신 및 FCCP 용액을 준비하기에 충분한 배지를 확보하십시오. 다음으로, 최적화 또는 분석 실행을 위해 웰당 세포 수가 증가함에 따라 플레이트 레이아웃을 설계한다. 네 개의 웰을 사용하여 미디어를 채우고 배경 측정을 위해 미디어를 주입하십시오.
앞서 준비한 T 세포를 계수한 후, 플레이트 레이아웃에 따라 미리 코팅된 XF 세포 배양 플레이트의 각 웰에 적절한 수의 세포를 피펫한다. T 세포를 코팅된 표면에 부착시키기 위해, XF 세포 배양 플레이트를 원심분리한다. 이어서, 세포를 200 마이크로리터의 분석 배지로 세척한다.
배지를 버리고 180 마이크로리터의 신선한 분석 배지를 첨가한다. 세포가 부착되고 웰 표면을 가로질러 고르게 분포되도록 한 후, XF 세포 배양 플레이트를 섭씨 37도에서 이산화탄소 조절되지 않은 가열 캐비닛에서 30분 동안 인큐베이션한다. 최적화 실행을 위해, 분석 매질에서 올리고마이신 및 FCCP의 작업 용액을 준비하십시오.
그런 다음 올리고마이신 또는 FCCP의 작동 용액을 센서 카트리지의 주입 포트에 로드하십시오. 주입 포트에 공기만 포함되어 있지 않은지 확인하십시오. 모든 빈 포트를 분석 매체로 채웁니다.
그런 다음 테이블 위의 플레이트 가장자리를 부드럽게 노크하여 주입 포트의 잠재적 인 기포를 제거하십시오. 분석 실행을 위해, 20-마이크로몰 안티마이신 A 용액을 제조하였다. 그런 다음 플레이트 레이아웃에 따라 20 마이크로 리터의 올리고 마이신 또는 FCCP를 센서 카트리지의 주입 포트 A에로드하고 22 마이크로 리터의 안티마이신 A를 모든 웰의 주입 포트 B에 첨가하십시오.
대표적인 올리고마이신 최적화 실행에서, 산소 소모율 또는 OCR의 고원은 누적 농도가 하나의 마이크로몰에 도달할 때 도달한다. 이 농도 이후부터, OCR은 더 이상 감소되지 않았다. 언커플러 FCCP의 증가된 농도로 처리된 세포의 경우, OCR 수준은 0.2 마이크로몰 FCCP까지 증가하였고, 그 후 고원에 도달하여, 완전한 비결합이 얻어졌다는 것을 나타낸다.
대표적인 세포 농도 최적화 실행에서, 200, 000 셀로 실행하기 위한 초기 OCR은 400, 000 셀로 그 중 대략 절반이다. FCCP 처리 후, 최대 OCR은 400, 000 세포에 대해 분당 61.6 피코몰, 000 세포 및 190.4 피코몰 400, 000 세포에 대해 분당 피코모이다. 올리고마이신 처리 후, 200, 000 세포로 실행되는 OCR은 한 자릿수로 붕괴되고 400, 000 세포로 실행된 OCR보다 낮다.
사이토카인 인터루킨-2와 인터루킨-15가 T 세포의 대사에 미치는 영향을 조사한 결과, 인터루킨-15 배양 세포는 더 높은 최대 호흡 및 예비 호흡 능력을 보유한다는 것이 밝혀졌다. 그러나 기저 호흡 및 ATP 생산은 영향을받지 않았습니다. 인간 T 세포에서 미토콘드리아 대사를 연구하는 것은 내구성과 생존 잠재력에 대한 중요한 단서를 제공합니다.
이것은 T 세포 적합성에 대한 지식을 증가시키고 궁극적으로 암 면역 요법 반응률을 향상시킬 수 있습니다.
