다양한 입자 정량화를 위한 방법은 대부분의 생물학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면 바이러스 성 데이터의 정확한 정량화를 실시간으로 허용합니다. 이 기술은 바이러스 데이터의 전통적인 측정을 대체합니다.
객관적인 실시간 데이터를 통해, 우리는 평가된 노동 집약적인 엔드포인트를 피하면서 신뢰 도면에 미치지 못하고 있습니다. 이 방법은 세포 병증 효과를 유도하는 모든 바이러스에 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 실험실 기술자 인 쿠엔틴 그라신 (Quentin Grassin)이 될 것입니다.
H1N1 바이러스를 전파하고 증폭하기 위해 표준 프로토콜에 따라 75 평방 센티미터 조직 배양 플라스크에 6 MDCK 세포에 7.5 배 10을 씨앗, 90 ~ 100 %의 합류에 도달하기 위해 섭씨 37도에서 24 시간 동안 세포를 배양. 다음 날, 세척당 플라스크 당 멸균 PBS 5 밀리리터로 세포를 두 번 세척하고 플라스크 를 대조군으로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 신선한 바이러스 전파 배지를 함유한 1.5밀리리터 튜브에서 적절한 실험 농도로 인플루엔자 A 바이러스 스톡의 해동 유리병을 희석한다.
희석된 주식의 1밀리리터를 사용하여 MDCK 세포를 1배 10의 감염으로 감염하여 음수 3, 또는 1회 10을 셀당 음수 4플라크 형성 단위로 감염시키고, 대조군 플라스크에 바이러스 전파 배지 1밀리리터를 첨가한다. 15분마다 저어주면서 실온에서 45분 동안 바이러스를 세포에 흡착시합니다. 인큐베이션의 끝에서, 접종을 제거하고 HA1 및 HA2 서브 유닛으로 바이러스 헤마글루티닌 HA0의 분열을 용이하게하기 위해 TPCK 트립신의 밀리리터 당 1 마이크로그램으로 보충된 바이러스 전파 매체의 15 밀리리터로 대체한다.
그런 다음 플라스크를 섭씨 35도 인큐베이터에 3일 동안 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포에 대한 세포 병증 효과를 평가하기 위해 가벼운 현미경에 40배 의 목표 하에서 각 배양에서 세포를 비교한다. 세포병증 효과가 완료되면 세포 배양 슈퍼나티를 15mm 튜브에 추가하고 원심분리에 의해 각 배양에서 세포 이물질을 수집합니다.
이어서, 15밀리리터 튜브로 명확한 바이러스 배양 상수체를 전송하고, 자손 바이러스를 영하 80도 저장을 위한 일회용 멸균 극저온 바이알로 알리쿼트한다. 세포 감염에 적합한 세포 수량을 결정하기 위해 PBS로 세포를 세척하고 플라스크 당 0.25 %의 3 밀리리터에서 45 분 배양으로 수확하기 전에 입증 된 대로 24 시간 약 80 %의 COfluent MDCK 세포 배양을 준비하십시오. 세포가 분리되면 플라스크 당 신선한 배양 배지의 7 밀리리터로 반응을 멈추고 각 배양에서 세포를 계산합니다.
세포 배양 배지의 밀리리터 당 5세포에 4배 10번으로 세포를 희석시키고 지시된 바와 같이 세포의 2배 연속 희석을 수행한다. E 플레이트의 전극을 만지지 않고 각 웰에 세포 배양 배지 의 100 마이크로 리터를 추가하기 전에 몇 분 동안 실온에서 전자 플레이트를 놓습니다. 요람의 잠금을 해제하고 임피던스 측정 기기의 요람 주머니에 플레이트 프런트 엔드를 삽입합니다.
인큐베이터의 문을 닫고 소프트웨어를 엽니다. 기본 실험 패턴 설정에서 선택한 요람을 강조 표시하고 상단 페이지를 두 번 클릭하여 실험 이름을 입력합니다. 레이아웃을 클릭하고 플레이트의 각 선택된 웰에 필요한 샘플 정보를 입력합니다.
일정, 단계 및 단계를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 배경 임피던스 클릭 실행 및 시작, 계속을 측정하기 위해 1 초 단계를 추가합니다. 플롯을 클릭하고 추가하여 적절한 우물을 선택하여 배경 임피던스가 다음 단계로 진행하기 전에 음수 0.1에서 0.1 사이임을 확인합니다.
다음으로, 요람에서 플레이트를 제거하고 각 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 복제하여 적절한 우물에 추가합니다. E 플레이트를 적층 유동 후드에 30분 동안 두어 E 플레이트를 요람 주머니에 적재하기 전에 우물 바닥에 셀을 균일하게 분배할 수 있도록 합니다. 일정 및 단계 추가값을 클릭하고 값을 입력하여 시작, 계속을 선택하기 전에 200회 반복을 위해 30분마다 셀을 모니터링합니다.
세포 임피던스 데이터를 확인하고 플롯하려면, 플롯을 클릭하고 바이러스 감염 중 여전히 성장 단계에있는 세포를 얻기 위해 시드 후 24 시간 고정 단계 24 시간 앞에 있는 세포의 농도를 선택합니다. CIT50 값과 감염의 복합성 사이의 상관관계를 결정하기 위해, 4회 갓 분할된 MDCK 세포를 전자 마이크로티터 플레이트의 각 웰로 3배 10배 배양한 후, 세척당 100마이크로리터의 신선한 바이러스 전파 배지로 세포를 2회 세척하고, 각 10개의 마이크로리터에 10개의 마이크로리터를 추가하여 10개의 마이크로리티터를 첨가한다. 모든 바이러스 희석제가 첨가되면 플레이트를 35도의 요람 주머니에 부드럽게 적재하고, 입증된 바와 같이 15분마다 세포 임피던스 모니터링을 시작한다.
측정의 두 주기 후, 장치를 일시 중지하려면 클릭하고 요람에서 전자 플레이트를 제거합니다. TPCK 트립신으로 보충된 100마이크로리터의 바이러스 전파 매체를 각 웰에 넣고 E 플레이트를 요람 포켓에 넣습니다. 그런 다음 분석을 시작합니다.
인플루엔자 A 바이러스 생존 운동학을 평가하기 위해 증류수의 리터당 35그램의 최종 농도에 염화나트륨을 추가하고, 결과식염수 의 900 마이크로리터를 2밀리리터 저온튜브에 추가합니다. 각 저온 튜브에 100 마이크로리터 바이러스 성 스톡을 추가하고 적절한 실험 기간 동안 35도 섭씨 인큐베이터에 튜브를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나기 전날, 종자 3배 10~4차 갓 분할된 MDCK 세포와 16웰 마이크로티터 플레이트당 100마이크로리터의 바이러스 전파 배지를 반복단계로 반복하여, 웰 의 바닥에 있는 세포의 배경 임피던스 및 균일한 분포를 측정할 수 있다.
그런 다음 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 성장시면 됩니다. 다음 날, 세포를 두 번 세척한 다음, 식염수 증류 바이러스의 100 마이크로리터로 세포를 감염시키고, 입증된 바와 같이 신선한 배양 배지에서 10회 희석하고, 적어도 100시간 동안 15분마다 세포 임피던스를 모니터링한다. 여기서, MDCK 세포의 상이한 농도로 120시간 후에 얻어진 원시 데이터가 도시된다.
24시간 후, 세포 지수 측정결과, 4세포에 3배 10으로 시드된 우물의 세포가 여전히 기하급수적인 성장 단계에 있었다는 사실이 밝혀졌으며, 따라서 이러한 세포 농도는 후속 실험에 사용되었다. MDCK 세포 배양은 인플루엔자 바이러스에 의한 CIT50과 초기 감염 복합성 사이의 명확한 선형 관계를 입증한다. 전형적인 생존 운동 실험에서 결과는 바이러스 유도 세포 병증 효과로 인한 세포 지수의 감소를 보여줍니다.
CIT50은 연구된 환경에서 가장 큰 안정성을 가진 바이러스의 판정을 위해 각 조건에서 각 바이러스에 대한 바이러스 불활성화 경사를 계산하는 데 사용될 수 있다. 바이러스의 안정성은 간접적으로 불활성화 경사와 상관관계가 있으며, 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 생존에 관여하는 헤마글루티닌 당단백질내의 아미노산 잔류물이 확인될 수 있도록 한다. 이 기술은 작은 변화에 매우 민감합니다.
따라서, 실험 사이에 재현 가능한 결과를 얻기 위해 자동 세포 카운터를 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 또한 다른 바이러스의 복제를 비교하는 데 사용할 수 있습니다, 한 번에 여러 세포주에 대한 바이러스 트로피즘을 조사, 또는 바이러스 주기의 특정 단계를 연구.
