이 프로토콜은 적응형 관리 리포터를 사용하여 접합 효율을 모니터링하기 위한 셀룰러 분석서를 설명합니다. 이 기자 분석은 엑손 또는 스플라이스 부위에 있는 질병 관련 돌연변이의 효력을 연구하고, 5점 스플라이스 사이트로 돌연변이의 인식을 향상시키기 위하여, 특정 한 입자를 디자인하기 위하여 이용될 수 있다. Hela 세포의 통로는 소비된 매체를 흡인하고 3분 동안 섭씨 37도에서 1밀리미터 EDTA를 포함하는 0.2 5%의 3밀리리터로 세포를 배양합니다.
신선한 DMEM의 7 밀리리터에서 배양 후 10 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다. 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 신선한 DMEM의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 과도 성 과도 성 전환에 대한 20 %의 합류로 새로운 조직 배양 접시에 세포를 플레이트.
깨끗한 헤모 세포계 슬라이드로 헬라 세포를 계산하고 밀리리터 당 5 세포에 2.5 배 10의 밀도로 현탁액을 준비하고, 셀 서스펜션의 1 밀리리터를 12 웰 플레이트의 각 우물로 시드하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 소비 된 매체를 흡인하고 접시에 세럼으로 신선한 DMEM 800 마이크로 리터를 추가합니다. 15초 동안 배분 믹스를 준비하고 소용돌이를 준비합니다.
그런 다음 원심 분리를 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 배양 후 200 마이크로리터를 모두 12웰 헬라 세포 플레이트중 하나의 우물에 추가하여 1밀리리터당 1밀리리터의 최종 부피를 달성하고 48시간 동안 37°C에서 플레이트를 배양한다. 준비된 라벨링 반응이 인큐베이팅되고 있습니다.
25킬로 달튼 분자량 컷오프 크기 제외 구슬을 10초 동안 부드럽게 소용돌이에 의해 재중단합니다. 다음으로 재매달된 구슬 600마이크로리터를 일회용 미니 컬럼으로 옮기고 1.5밀리리터 수집 튜브에 넣고 구슬 재고를 섭씨 4도로 되돌려 놓습니다. 열을 원심 분리하고 열을 통해 흐름을 삭제합니다.
그런 다음 기둥에 RNA 프리 워터 300 마이크로리터를 추가하여 구슬을 두 번 씻는다. 두 번째 세척 후 미니 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 컬럼에 키나아제 반응 믹스를 추가합니다. 원심분리기 컬럼을 원심분리하고 P32 표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하여 흐름을 수집한다.
헬리 세포에서 추출한 RNA 2마이크로그램을 200마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고 RNA 프리 워터를 추가하여 6.55 마이크로리터에 볼륨을 구성합니다. 다음으로 RNA 샘플을 포함하는 각 PCR 튜브에 마스터 믹스 1개를 추가하고, 튜브를 섭씨 65도에서 5분 동안 먼저 배양한 다음 얼음에 1분 동안 배양합니다. 다음으로 2.55 마이크로리터, 마스터 믹스 2, RNA및 마스터 믹스 를 포함하는 각 튜브에 10 분 동안 실온에서 튜브를 배양한다.
인큐베이션 후 튜브를 열 사이클러로 옮기고 먼저 섭씨 50도에서 60분 동안 배양한 다음 섭씨 70도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 각 샘플에 2X 폼아미드 RNA 로딩 염료의 10 마이크로리터를 추가하고 UIA 페이지별로 조각을 분리한다. 퍼시 DNA 합성.
200 마이크로리터 미크론심심분리기 튜브에 대용량 헬라 세포에서 추출한 RNA 2마이크로그램을 추가하고, RNA가 없는 물을 추가하여 11마이크로리터에 부피를 만회합니다. 다음으로, 두 개의 마이크로리터를 추가하고, 마스터 믹스를 각 샘플에 하나씩 넣고 5분 동안 섭씨 65도에서 먼저 배양한 다음 1분 동안 얼음위에 누배합니다. 다음으로, 각 튜브에 마스터 믹스 2인 7개의 마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 튜브를 배양한 다음, 60분 동안 50도, 섭씨 70도에서 15분 동안 인큐베이션을 합니다.
다음으로, PCR의 경우 C DNA 반응을 희석하여 마이크로리터당 100나노그램의 농도를 산출하고 각 CDNA 샘플의 마이크로리터 1개를 새로운 PCR 튜브로 전송한다. CDNA를 포함하는 각 튜브에 마스터 믹스의 10.5 마이크로리터를 추가하고 PCR을 수행합니다. PCR이 완료된 후 열순환기 사용.
각 튜브에 2X 폼아미드 DNA 로딩 염료의 12.5 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 가열하고 UIA 페이지를 진행합니다. 96웰 qpcr 플레이트 트리플리케이트의 개별 우물에 희석 된 CDNA의 파이펫 5 마이크로 리터.
다음으로 각 웰에 실시간 PCR 믹스 10 마이크로리터를 추가하고, 광학 필름으로 플레이트를 밀봉하고, 원심분리기를 사용하여 우물 바닥에 대한 반응을 수집한 다음, 대상 앰플리콘의 임계 정량화 주기 값을 수집하는 동안 qpcr를 수행합니다. 마커와 샘플을 로드하기 전에 TBE 버퍼로 우물을 플러시하여 정착된 우레아를 제거합니다. 그런 다음 각 샘플당 10 마이크로리터를 적재하고 2~3시간 동안 300~500볼트로 젤을 실행하거나 자일렌이 바닥에 닿을 때까지 실행합니다.
전기전도후 전기포고가소장치에서 유리판을 제거하고 두 판을 조심스럽게 분리하여 젤이 유리 표면에 평평하게 놓이도록 한 다음, 젤을 필터 용지에 옮기고 플라스틱 랩으로 덮어 젤 건조기 진공을 사용하여 30분 동안 젤을 건조시하고, 그런 다음 건조 된 젤을 실내 온도에서 하룻밤 잠식용 인광 화상 진찰 카세트에 놓습니다. 헬라 세포에서 발현되면, 슬라이스 리포터 dup 51 minnijean은 엑손 2가 효율적으로 접합되는 성숙한 전체 길이 의 성적 증명서를 표현한다. 5개의 주요 스플라이스 사이트 돌연변이 및 dup 51 P는 엑손2개의 포함을 95에서 30%로 감소시켜 더 짧은 성적증명서의 형성으로 이끌어 냅니다.
U15A SNRNA를 가진 dup 51 P의 공동 발현은 엑손2개의 접합을 구출하고, 전체 길이 성적증명서의 형성을 복원합니다. 대조적으로, 야생 형 U1 또는 U15G 변종과의 공동 발현은 dup 51P 접합에 유사한 영향을 미치지 않습니다. U15A 변이체 전사체의 검출은, 1차 연장에 의하여 U1 7~26개의 올리고 뉴클레오티드를 사용하며, 이는 U1 SNRNA의 다섯 번째 위치에서 아데닌 근처의 20개의 뉴클레오티드 및 기저쌍이다.
DATP단독으로, U1 7 내지 26은 내인성 야생형 U1 SNRNA에 대해 2내지 3개의 뉴클레오티드를 통합하여 22 또는 23뉴클레오티드 롱 생성물을 산출할 수 있다. U15A 및 U15G 변이체의 경우 21개의 뉴클레오티드 생성물을 생산하는 단일 아데노신을 첨가한 후 확장이 종료된다. U2 SNRNA 발현으로 의정상화 한 후, 내생SNRNA를 통해 3~5배의 내생SNRNA를 통해 U1 야생형 U1 5g 및 U15A 변이체를 3~5배로 발현했다.
추출된 RNA의 품질은 접합 분석에 매우 중요합니다. 따라서 RNA 가없는 물의 사용 및 RNA 비활성화 제로 서비스의 오염 제거가 매우 권장됩니다. 여기에 설명된 보고 시스템은 수정 U1SN RNA를 사용하여 유전자 침묵에 대한 돌연변이를 접합하기 위한 규정을 접합하기 위한 규정을 접합하는 U1 SN RNA의 역할을 연구하기 위하여 적용될 수 있다.
