ECLIA는 MeCP2의 세포 수준을 정량화하는 간단하면서도 효율적인 방법입니다. ECLIA는 서양 블롯 및 ELISA와 같은 다른 정량화 방법에 비해 빠르고 민감하며 취급하기가 쉽습니다. PBS에서 0.5%Tween 20인 세탁 용액을 준비하려면 500 마이크로리터의 Tween 20을 PBS 1리터에 넣고 적극적으로 혼합합니다.
3%블로커 A와 PBS의 블로킹 용액을 준비하고 부드럽게 저어줍니다. 여과로 차단 용액을 살균합니다. 분석 희석 솔루션, 1%Blocker A 및 PBS를 준비하려면 PBS 의 10 밀리리터에 블로킹 솔루션 5밀리리터를 추가합니다.
다음으로 얼음에 단클론 마우스 항 MeCP2 항체를 해동. 항체의 0.67 마이크로리터를 PBS의 4밀리리터와 혼합한 다음 용액을 소용돌이시다. 96웰 높이의 바인드 플레이트를 코팅하려면 멀티채널 파이퍼를 사용하여 코팅 용액 25마이크로리터를 각 웰의 하단 모서리에 조심스럽게 분배합니다.
코팅 용액이 각 우물의 바닥을 덮는지 확인하기 위해 각 면에 96 웰 플레이트를 부드럽게 두드려. 접착제 호일로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 냉장고에서 96웰 플레이트를 회수하고 호일을 제거합니다.
이를 폐기물 용기로 밀어 서 우물내의 항체 코팅 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다. 다음으로 각 웰에 125마이크로리터의 블로킹 솔루션을 추가합니다.
그런 다음 접착제 호일로 접시를 다시 밀봉합니다. 800 RPM에 설정된 궤도 마이크로 플레이트 셰이커에 플레이트를 놓고 실온에서 90분 동안 배양합니다. MeCP2 또는 Tat-MeCP2 단백질 스톡 솔루션, 마우스 뇌 용액 및 HDF 용액의 얼음 1부 바이알을 얼음 위에 해동합니다.
원고의 표 2에 설명된 대로 깨끗한 튜브에 단백질 스톡 용액을 희석시. 다음으로 lysate 샘플을 희석시. 마우스 뇌 용해물의 경우, 용해 버퍼의 25 마이크로 리터 당 1 ~ 20 마이크로 그램을 사용합니다.
HDF 용액의 경우 25마이크로리터당 0.25마이크로그램에 1마이크로그램을 추가합니다. 96웰 플레이트가 90분 동안 배양한 후, 이를 폐기물 용기로 밀어서 우물에서 차단 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다.
그런 다음 세척 용액 150 마이크로리터로 플레이트를 세 번 씻고 즉시 제거하십시오. 96웰 플레이트의 우물에 표준 및 샘플 25 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 일정한 800 RPM 흔들림과 실온에서 또 다른 4 시간 동안 인큐베이션.
표지가 없는 검출 항체, 폴리클론 토끼 항-MeCP2를 얼음 위에 해동하십시오. 분석 희석용액을 사용하여, 항체를 1 대 6, 000의 비율로 희석한다. 96웰 플레이트가 셰이커에 인큐베이팅이 완료되면 플레이트를 폐기물 용기에 밀어 서 표준 및 샘플을 제거합니다.
그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다. 세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 마이크로 리터의 세척 용액으로 접시를 세 번 씻습니다. 다중 채널 파이퍼를 사용하여 라벨이 부착되지 않은 검출 항체 용액 25마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.
접시를 밀봉하고 800 RPM에서 일정한 흔들림과 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 냉장고에서 특정 이차 항체를 얻고 하나의 얼음을 놓습니다. 보조 바디를 분석 희석 용액으로 희석하고 부드럽게 섞습니다.
96웰 플레이트에서 라벨이 없는 무료 검출 항체를 제거하려면 폐기물 용기에 넣은 다음 종이 타월에 접시를 누릅니다. 플레이트를 3배 나 세척한 후, 멀티채널 파이프터와 함께 각각 25마이크로리터의 이차 항체를 첨가한다. 접시를 밀봉하고 800 RPM에서 일정한 흔들림과 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션.
폐기물 용기에 넣고 종이 타월에 접시를 두드리고 이전에 설명한 대로 플레이트를 세 번 세척하여 자유 이차 항체를 제거합니다. 플레이트의 각 웰에, 150 마이크로 리터의 150 계면 활성제로 골드 읽기 버퍼, 광 생성을위한 코어 액터로 트리 프로필라민을 포함. 기포를 생성하지 않으려면 역파이프팅 기술을 사용하십시오.
전기 화학 발광 검출 시스템을 갖춘 마이크로 플레이트 플랫폼에 96웰 플레이트를 배치합니다. 내장된 CCD 카메라를 사용하여 즉시 데이터 캡처를 시작합니다. 상대광 단위에 대응하고 빛의 강도에 직접 비례하는 기록 신호 카운트.
MeCP2 표준 곡선은 여러 측정에서 인간 MeCP2로부터 생성되었습니다. ECLIA는 밀리리터당 1나노그램에서 밀리리터당 1800나노그램의 범위에서 재조합 인간 MeCP2를 정확하게 정량화할 수 있습니다. ECLIA를 사용하여, MeCP2 단백질 수준은 이종화구와 여성 야생형 마우스와 1개의 MeCP2 녹아웃 마우스에서 두뇌 핵 용액에서 측정되었습니다.
ECLIA는 건강한 대조군으로부터 세포 용액및 레트 증후군의 모델로 사용되는 c. 806delG 세포주로부터 수행되었다. ECLIA 또는 면역 형광에 의해 돌연변이 세포주에서 MeCP2 단백질이 검출되지 않았다.
ECLIA는 또한 MeCP2 결핍 세포주 초과 근무에 의해 Tat-MeCP2의 uptake를 조사하는 데 사용되었다. ECLIA 인터 및 내 분석 정밀도는 3일 연속 으로 결정되었다. 미래의 단백질 대체 요법을 위해, MeCP2 전달은 ECLIA에 의하여 단백질 수준 평가에 따라 반복적으로 최적화될 수 있습니다.
