이 프로토콜의 전반적인 목표는 생체 외에서 tRNA-Isopentenyl Transferase 활동을 생화학적으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 정제된 재조합 효소의 tRNA-isopentenyl 전달 활성의 체외 검출 및 특성화에 유용하다. 이 기술의 주요 장점은 공유 RNA 수정을 검출하는 데 사용되는 간단하고 직접적인 분석이라는 것입니다.
이 방법은 tRNA-isopentenyl 전달 효소 활동에 대한 통찰력을 제공하지만, 넓은 범위 또는 RNA 변형 효소의 생화학적 특성화에 잠재적으로 적응할 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 젤을 주조하는 데 사용되는 유리 판을 철저히 청소하는 것입니다. 접시를 비누와 물로 씻고, 탈이온화된 물로 잘 헹구고, 이소프로파놀과 보풀이 없는 물티슈로 접시를 청소합니다.
다음으로 플레이트와 스페이서를 조립합니다. 다음 시약을 섞어 100 밀리리터 20% 아크릴아미드, 7.5 어어 우레아, 1x TBE 젤을 만듭니다. 우레아 젤 농축액 80밀리리터, 우레아 젤 희석제 10밀리리터, 10밀리리터의 우레아 젤 버퍼.
T-med 40 마이크로리터와 800 마이크로리터를 새로 준비한 10% 암모늄 과황을 혼합물에 넣습니다. 겔 용액을 큰 주사기로 끌어올려 유리를 두드리는 유리 판 사이에 젤 용액을 분배하면서 거품 형성을 방지하기 위한 용액을 분배합니다. 젤이 실온에서 30분 동안 고화되도록 합니다.
젤이 고화된 후, 젤을 수직 젤 장치에 심습니다. 상부 및 하부 버퍼 챔버를 1x TBE로 채웁니다. 젤을 적재하기 2시간 전에, 완충 경계가 가장 작은 올리고뉴클레오티드를 실행할 수 있도록 2시간 동안 20 밀리암페어에서 젤을 미리 실행한다.
RNA에 대한 각 반응을 17 마이크로리터의 최종 부피에서 opentenylation 분석체로 준비한다. 각 튜브 50 밀리몰러 트리스-HCl, pH 7.2, 1.2 밀리몰러 ATP, 염화 마그네슘 5.8개, 밀라 디엠앱 0.2개, RNase 억제제 10개, CPM 내부 32P, 5.3 마이크로모라 Mod5, 1.2.메르아갈라 에 추가 1 시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양하십시오.
1시간 후, 에탄올은 100%에탄올의 2.5부부와 1/10부로 1/10부로 1시간 동안 20도를 침전시키고, 하룻밤 사이에 마이너스 20도를 배치한다. 다음으로 RNA 샘플을 15, 400g, 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 70 %의 마이크로 리터 500 마이크로 리터로 각 RNA 펠릿을 세척하십시오.
샘플을 15, 400g, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 RNA 펠릿을 15분 동안 또는 모든 에탄올이 증발할 때까지 건조시다. 다음으로 8개의 어금니 우레아의 10마이크로리터에서 각 RNA 펠릿을 다시 중단한다.
각 샘플에 150 단위의 RNase T1을 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오. 다음 날 각 샘플에 6x 로딩 버퍼의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 사전 실행, 20% 폴리 아크릴라미드, 7.5 어어 우레아 젤에 각 RNA 샘플의 10 마이크로리터를 로드합니다.
젤을 25 밀리암페어에서 2시간 동안 실행합니다. 2 시간 후, 전기 전도를 중지하고 장치에서 젤을 제거합니다. 두 유리 판 사이에 씰을 부수고 어느 접시에 젤이 남아 있는 유리 판 중 하나를 조심스럽게 제거합니다.
젤 위에 플라스틱 랩을 놓고 인 스크린에 3시간 동안 노출합니다. 이 프로토콜은 S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5에 의해 수정된 정식 및 비관적 tRNA 잔류물의 개방성을 안정적으로 감지합니다. 이 예에서 티로신 tRNA는 내부적으로 32P-아데노신으로 표시되었고 Mod5는 DMAPP의 존재 또는 부재에서 RNase로 배양되었다.
RNA는 RNase T1로 소화되었고, 탈질 폴리아크릴아미드 젤로 해결되었습니다. Mod5는 DMAPP의 존재에서 예측된 잔류물을 수정하고, 뉴클레오시드 위치에서 단편을 포함하는 10개의 뉴클레오티드, 삼중 아데노신이 티로신 tRNA에서 단편을 함유하고 있다. 수정된 아데노신(37)은 별표로 표시됩니다.
유사하게 세린 tRNA가 Mod5 및 DMAPP로 배양될 때, 뉴클레오시드 위치에서 단편을 포함하는 10개의 뉴클레오티드 삼중 아데노신의 완전한 변화가 관찰된다 36~38. 흥미롭게도, 뉴클레오시드 위치(36~38)에서 단편을 함유하는 삼중 아데노신을 포함하지 않는 7개의 뉴클레오티드 단편의 부분적 변화는 뉴클레오시드 위치에서 단편을 포함하는 삼중 아데노신이 36~38개의 서열 및 구조가 Mod5 체외 활성에 필요하지 않을 수 있음을 시사한다. 이 기술을 익히면 제대로 수행되면 2일 에서 4~6시간이 소요됩니다.
RNA 분해가 RNA 수정에 영향을 미치고 데이터 해석을 혼동할 수 있기 때문에 이 절차를 잘 시도하는 것은 RNA의 무결성을 유지하고 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 관심있는 효소를 사용하여이 절차 돌연변이 연구에 따라 효소 활동에 필요한 특정 잔류물 또는 도메인을 결정하기 위해 수행 할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 RNA 생물학 분야의 연구자들이 장핵 효소와 진핵 효소의 tRNA-isopentenyl 전달 활동을 말하는 길을 열었습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 효소의 isopentenyl transferase 활동을 감지하기 위한 프로토콜을 수행하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 방사능으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 PPE 착용, 적절한 차폐 사용 및 방사능 폐기와 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.
