다음 방법 문서의 전반적인 목표는 공초점 현미경 검사법과 결합된 광학 핀셋을 사용하여 단백질 또는 기타 요인과의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 유용한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 지난 10 년 동안, 단일 거대 분자의 특성을 조사하기 위해 몇 가지 정교한 기술이 개발되었습니다. 이러한 기술 중 하나는 단일 분자 광학 핀셋입니다.
새로운 형광 보조 광학 핀셋으로 RNA 분자의 전개에 필요한 힘뿐만 아니라 번역 중 바인딩 이벤트를 자세히 모니터링 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 RNA 분자가 번역을 통제하는 요인을 유무에 관계없이 뻗어 있는 측정에 집중합니다. 또한 라벨이 부착된 리보솜을 사용하여 번역을 모니터링하기 위해 이 기술을 적용할 수 있는 방법을 설명합니다.
이 프로토콜은 루카스 페카렉과 스테판 파크의 두 대학원생에 의해 입증될 것입니다. 이 비디오에서는 광학 핀셋 실험의 설정 및 실행을 안내할 것입니다. 또한 간단한 데이터 분석 워크플로우에 대해서도 설명합니다.
이 기술의 장점은 간단하고 견고하다는 것입니다. 분자는 레이저 빔의 초점에 묶여 두 구슬 사이에 묶여 있으며, 변위 시 의 변화와 힘은 소위 힘 램프 실험에서 정확하게 측정될 수 있습니다. 테더 내부의 이차 구조는 분자의 내부 에너지에 따라 특정 힘으로 전개됩니다.
여러 구조 간의 동적 전환은 일정한 힘 측정을 통해 더 자세히 조사할 수 있습니다. 더욱이, 형광 이미징의 병렬 사용은 실시간으로 결합 이벤트를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 테더의 고유한 힘 거리 프로파일은 안정성에 영향을 미치는 잠재적 인 트랜스태이트 요인을 결합 한 후 달라질 수 있습니다.
첫째, 관심있는 RNA는 DNA 벡터로 복제되어야합니다. 이 서열의 상류 및 하류, 추가 부품, 핸들은 구슬 사이의 최종 DNA-RNA 구조를 연결하는 데 필요합니다. 플라스미드의 성공적인 복제 및 증폭 후, 세 가지 다른 PCR 반응이 수행됩니다.
각 PCR 반응에 대해 프로토콜의 표 하나에 따라 시약을 혼합합니다. 적절한 열 사이클러에서 50 마이크로리터 알리쿼트에서 PCR을 실행합니다. 첫 번째 는 후속 시험관 내 전사를 위한 T7 프로모터와 함께 전체 구조의 이중 좌초 된 DNA를 초래합니다.
두 번째 PCR은 다섯 개의 주요 핸들을 생성합니다. 마지막 반응은 세 가지 주요 핸들을 초래하는 반면. 5 개의 프라임 핸들과 3 개의 프라임 핸들은 사용 된 구슬에 따라 레이블을 지정해야합니다.
3개의 프라임 핸들은 PCR 중에 디곡시게닌 라벨이 부착된 역프라이머를 사용하여 표지되며, 5개의 프라임 핸들은 생물성 화를 통해 추가 단계로 레이블을 지정해야 합니다. 5개의 프라임 핸들의 3개의 주요 생체화는 T 40 및 폴리머라제를 사용하여 수행됩니다. 반응은 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 수행됩니다.
다음으로, T7 폴리머라제를 사용하여 체외 내 전사를 수행한다. RNA의 길이에 따라 2~4시간 동안 37도에서 반응을 배양한다. 마지막 단계에서, 손잡이는 이중 좌초된 손잡이 사이의 단일 좌초 된 영역을 가진 최종 DNA-RNA 구조를 얻기 위해 시험관 내 전사로부터 RNA로 어닐링된다.
원하는 RNA-DNA 하이브리드를 음닐하려면 손잡이와 RNA를 아닐링 버퍼에 섞는다. 열, 10 분 동안 최대 85도의 혼합물을 가열한 다음 샘플을 4도로 천천히 식힙니다. 어닐드 샘플을 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 1/10부와 3권의 얼음 냉간 에탄올을 혼합하고 최소 한 시간 동안 마이너스 80도를 배양합니다.
원심 분리시 샘플을 15, 000 xg에서 4도에서 30 분 동안 분리합니다. 상체를 버리고 진공 상태에서 펠릿을 말리십시오. 재부유된 펠릿의 작은 알리쿼트(aliquots)는 액체 질소로 동결되어 사용될 때까지 영하 80도까지 보관됩니다.
먼저 주사기에서 표백제를 제거하고 RNase 무료 물 1 mL를 채웁니다. 0.5 개의 어금니 나트륨 티오술파테의 50 마이크로 리터를 추가하고 하나의 바로 시스템을 씻어. 미세 유체 시스템은 시스템의 기포를 피하기 위해 건조하게 실행되지 않도록주의하십시오.
다음으로, 나머지 나트륨 티오술파테액을 버리고 주사기를 새로운 것으로 대체한다. 그런 다음 RNase 무료 물 0.5mL 이상으로 다시 씻으십시오. 기계의 광학 시스템을 설정하려면 두 방울의 침지 오일을 목표에 넣습니다.
유동 셀을 제자리에 놓고 액체가 유동 셀에 닿을 때까지 목표를 상승시보입니다. 그런 다음 유량 셀 위에 침지 오일 2 방울을 넣습니다. 이제 트랩 스티어링 유닛과 트래핑 레이저를 켭니다.
목표는 기계의 진단 카메라의 Z 파인더 도구를 사용하여 조정됩니다. 마이크로 나사를 돌리면 Z 축은 두 번째 와 세 번째 반사 사이의 챔버 의 중간으로 조정됩니다. 굴절 링이 가장 큰 곳입니다.
진단 카메라를 달 모드로 전환하고 트래핑 레이저를 약 50 %로 줄인 다음 응축기를 낮추고 위치를 조정하여 약 10 개의 라이트 밴드를 볼 수 있습니다. 측정 챔버에는 5개의 채널이 있으며 실험 전에는 다른 설정 가능성을 고려해야 합니다. 간단한 힘 램프 실험을 위해 구슬 버퍼 구슬은 편리한 채널 배열입니다.
형광 리보솜 이나 거래 인자와 같은 네 번째 화합물을 가진 측정의 경우 구슬 구슬 버퍼 계수는 더 나은 배열이지만 구슬을 잡기가 더 어려워집니다. 어닐링 된 구조의 알리쿼트는 3 개의 마이크로 리터 AD 비드 서스펜션, 1 개의 마이크로 리터 RNase 억제제 및 실온에서 분석 버퍼의 8 마이크로 리터로 10 ~ 20 분 동안 배양됩니다. 그런 다음 샘플은 500 마이크로리터 분석 버퍼로 희석되어 각 채널에 넣습니다.
두 번째 종류의 구슬의 경우, 분석 구슬의 0.8 마이크로리터는 분석 버퍼의 1mL와 혼합되어 해당 채널로 투여된다. 채널은 열어 저압으로 세척됩니다. 이제 트랩핑 레이저를 켭니다.
구슬을 잡기 위해 레이저는 서로 떨어져 이동하고 AD 비드는 함정 하나에 잡힙다. 다음으로 무대는 SA 비드 채널로 이동하고 비드는 트랩 2에 잡힌다. 구슬을 잃지 않도록 하거나 동일한 트랩에서 두 번째 트랩을 잡으려면 스테이지가 버퍼 채널로 이동하고 모든 채널이 닫힙습니다.
버퍼에서 트랩 보정이 수행됩니다. 잡힌 구슬은 후속 측정을 위한 시각적 템플릿으로 설정해야 합니다. 그리고 유사성 점수는 비교를 보장하기 위해 측정 사이에 90 % 이상 유지해야합니다.
마지막으로 구슬은 서로 더 가깝게 이동하고 하나의 밧줄을 잡기 시작할 수 있습니다. 이것은 몇 초 동안 구슬을 닫은 다음 천천히 구슬을 다시 출발합니다. 밧줄 형성은 두 구슬을 서로 떼어낼 때 측정된 힘의 증가를 초래한다.
테더의 수와 품질은 오버스트레칭 고원을 찾아서 확인할 수 있으며, 궤적을 자유롭게 조인트 체인 또는 웜과 같은 체인 모델과 비교할 수 있습니다. 오버 스트레칭 고원은 단일 밧줄에 대한 50 에서 60 피코 뉴턴 사이여야한다. 형광 측정을 수행하려면 공초점 레이저와 광자 수를 단위 및 광학 핀셋 기계에 켭니다.
그 후, 원하는 파장 및 소프트웨어 인터페이스의 흥분 레이저를 켜고 불소에 따라 레이저의 힘을 5% 이상으로 설정합니다. 이제 이미징은 소프트웨어의 이미지 또는 kymograph 기능을 사용하여 시작할 수 있습니다. 잘 초점을 맞춘 이미지를 얻으려면 공초점 현미경과 광학 트랩의 초점 평면이 정렬되어 있는지 확인하십시오.
이를 위해, 블루 레이저 채널에서 폴리스티렌 구슬의 자동 불발성을 사용할 수 있다. 구슬의 자동 불발성이 가장 높은 직경에 도달 할 때까지 광학 트랩의 초점 평면으로 위아래로 이동합니다. 이 위치에서, 테더드 분자에서 일어나는 형광 신호는 검출될 수 있다.
두 함수 모두 관심 영역을 선택하는 것이 중요합니다. 측정 버퍼 조성 전반에 걸쳐 구슬을 다른 채널로 이동하거나 미세 유체 시스템에서 제공되는 버퍼를 변경하여 쉽게 변경할 수 있습니다. 광표백을 피하려면 측정하지 않을 때 항상 흥분 레이저를 끕니다.
장치에서 원시 데이터 출력에는 많은 노이즈가 자주 포함되어 있습니다. 따라서 분산된 데이터를 추가로 분석하기 위해 먼저 미리 처리해야 합니다. 첫 번째 단계는 낮은 패스 버터 워스 필터로 샘플을 다운하고 데이터를 필터링하는 것입니다, 좋은 결과를 얻었다.
힘 경사로 실험의 경우, 전개 이벤트는 웜과 같은 체인 또는 자유롭게 조인트 체인 모델을 사용하여 장착할 수 있는 제1 거리 곡선의 접히고 전개된 영역에 표시되어야 합니다. 상수 력 데이터의 경우, 시간이 지남에 따라 의 거리를 플로팅할 수 있으며 주어진 힘에서 우세한 변형을 정량화하기 위해 히스토그램을 생성하는 것이 유용하다. 여기서 필터 매개 변수는 다른 접이식 상태를 구별하는 데 중요한 것으로 나타났습니다.
이 기술로 달성 할 수있는 것을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 대표적인 결과가 표시됩니다. 이것은 힘 램프 실험에서 표준 힘 거리 곡선처럼 보이는 방법입니다. 이 경우 SARS-코로나바이러스-2 프레임 이동 요소를 연구했습니다.
우리는 15 피코 뉴턴 주위에 여러 단계에서 전개 관찰. 방향이 반전되고 구슬이 다시 가까워지면 밧줄이 약간 낮은 힘으로 다시 접습니다. 아연 손가락 항바이러스 단백질 ZAP의 존재에서 동일한 RNA를 측정했을 때, 유사한 전개 패턴이 관찰되었다.
그러나 RNA의 이차 구조는 다시 접지하지 않았다. 이것은 단백질 결합이 RNA 운동학에 미칠 수 있는 어떤 큰 영향을 보여주기 위하여 좋은 보기입니다. 일정한 힘 데이터를 살펴보면 전개되는 운동학을 더 조사할 수 있습니다.
시간이 지남에 따라 거리는 다른 힘에 대한 플롯과 다른 관찰 상태의 히스토그램이 오른쪽에 추가됩니다. 10 piconewton에서, RNA는 접힌 상태에 완전히 이다. 11.5 piconewton에서 그것은 상태 사이 전환, 그리고 13 piconewton에서 RNA는 전개 된 상태에서 영구적으로.
그러나, SARS-코로나바이러스-2 프레임 이동 소자를 ZAP와 함께 측정했을 때, RNA는 11 piconewton에서 완전히 전개된 상태에 있었고, 심지어 10 piconewton에서 접힌 상태로 거의 전환되지 않았다. 이는 ZAP가 단일 좌초프레임 이동 요소에 바인딩되어 보조 구조의 형성을 방지한다는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 우리는 공초점 현미경 검사법과 결합된 몇몇 광학 핀셋 데이터를 볼 것입니다.
이 실험에서, 형광염은 이중 가닥 핵산을 라벨을 붙이는 데 사용되었으며, 이는 특별히 증가하는 힘으로 비하여 사용되었다. kymograph는 구슬이 서로 떨어져 이동함에 따라 형광 강도가 증가하고 밧줄이 너무 많이 뻗어 나면 완전히 사라진다는 것을 보여줍니다. 마지막 그림에서 형광으로 표시된 리보솜은 채널 4를 통해 첨가되었다.
본 실험에서 RNA 밧줄에 특이적인 리보솜 결합이 관찰되었다. 이 비디오가 광학 핀셋에 대한 통찰력을 주었고 이 놀라운 기술을 수행할 수 있는 것이 무엇인지 바랍니다.
