이 프로토콜은 식물 숙주에서 이러한 단백질의 기능을 추가로 조사하기 위해 딱정벌레 및 식물 숙주의 타액 단백질을 검출하는 기술을 제공합니다. 이 기술은 수행하기 쉽고 시스템은 안정적이고 복제 가능합니다. 이 방법은 또한 다른 편엽 및 식물 숙주의 타액 단백질을 검출하는 데 도움이 될 수 있습니다.
시작하려면 40 x 35 x 20cm 큐브 케이지에서 벼 묘목에 성인 딱정벌레를 키우십시오. 케이지의 한쪽을 환기를 위해 방충망으로 덮으십시오. 딱정벌레와 함께 케이지를 섭씨 26도, 상대 습도 60-75 %의 내장 습도 조절기가 들어있는 인큐베이터에 넣고 16 시간의 빛과 8 시간의 어둠의 사진 기간 동안 놓습니다.
일주일에 한 번, 흡인기기를 사용하여 모든 성인을 새장에서 신선한 벼 묘목이 들어있는 새 새장으로 부드럽게 옮깁니다. 200명 이상의 성인이 밥에 짝짓기를 하고 알을 낳도록 합니다. 님프가 출현할 수 있도록 오래된 벼 묘목을 유지하고 이 새로운 비독성 님프를 두 번째 인스타 단계로 키웁니다.
흡인기(aspirator)를 사용하여 두 번째 instar 비독성 님프를 굶주림을 위해 1-2시간 동안 유리 배양 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 화분에서 자란 벼 난쟁이 바이러스에 감염된 벼가 들어있는 새장에 님프를 풀어주고 님프가 감염된 벼를 이틀 동안 먹도록합니다. 이틀 후,이 님프를 신선한 바이러스가없는 벼 묘목이 들어있는 새 새장으로 조심스럽게 옮기고 님프가 12 일 동안 바이러스가없는 벼 묘목을 먹게하여 벼 난쟁이 바이러스의 순환 전염 기간을 완료하십시오.
타액 단백질을 수집하려면 한쪽 끝에 방충망으로 덮인 5 개의 작은 파이프 모양의 먹이 케이지를 준비하십시오. 각 먹이 케이지에 15-20 마리의 딱정벌레를 가둔 후 케이지의 다른 쪽 끝을 얇은 폼 매트로 덮습니다. 케이지 끝과 폼 매트 사이에 벼 묘목 하나를 테이프로 고정하여 먹이 케이지의 딱정벌레가 케이지 내부에 노출된 벼 묘목을 먹을 수 있도록 합니다.
벼가 살아 남을 수 있도록 묘목 뿌리를 물에 담그고 딱정벌레가 이틀 동안 먹을 수 있도록하십시오. 이틀 후, 먹이 케이지에서 딱정벌레를 제거하고 딱정벌레가 먹은 벼 묘목을 모으십시오. 새장 밖에서 묘목을 자르고 묘목의 먹이 지역을 회복하십시오.
준비된 5x 완충액 200ml를 멸균수 800ml로 희석하여 1x Tris-Glycine 완충액을 준비합니다. 그런 다음 10x TBS 버퍼를 준비하고 섭씨 121도에서 15분 동안 용액을 오토클레이브합니다. 다음으로, 4x 단백질 샘플 버퍼를 준비합니다.
그런 다음 800 밀리리터의 트리스-글리신 완충액과 200 밀리리터의 메탄올을 혼합하여 전달 완충액을 준비합니다. 마지막으로, 100 밀리리터의 10x TBS와 3 밀리리터의 트윈 20 내지 900 밀리리터의 멸균수를 첨가하여 TBST 용액을 준비한다. 타액과 바이러스 단백질을 검출하려면 조직이 분말이 될 때까지 액체 질소로 쌀 샘플 0.1g을 분쇄하십시오.
그런 다음 200마이크로리터의 4x 단백질 샘플 버퍼를 샘플에 넣고 10분 동안 끓입니다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 새 바이알에 옮깁니다. 10마이크로리터의 샘플을 SDS-PAGE 젤에 로드하고 150볼트에서 45-60분 동안 Tris-Glycine 버퍼에서 실행합니다.
겔이 작동하는 동안 0.45 미크론 니트로셀룰로오스 멤브레인 및 기타 샌드위치 공급물을 30분 동안 전달 완충액에 넣습니다. 실행 후, 겔을 샌드위치하고 전달 완충액에서 100 볼트에서 90 내지 120 분 동안 이송한다. 블로팅이 완료되면 멤브레인을 TBST의 7% 무지방 분유 차단 용액에 넣고 20분 동안 배양합니다.
그 후, 쌀 난쟁이 바이러스 P8 또는 vitellogenin에 대한 항체를 추가하고 2 시간 또는 밤새 막을 배양하십시오. 배양 후, 각 세척 사이에 5분 배양으로 TBST로 멤브레인을 3회 세척합니다. 그런 다음 염소 항토끼 IgG를 2차 항체로 첨가하고 60분에서 90분 동안 멤브레인을 배양합니다.
ECL Western 키트를 1:1의 비율로 키트의 혼합 검출 시약 1과 2에서 화학발광 검출에 사용합니다. 멤브레인을 혼합 시약에 넣고 5분 동안 블롯을 배양합니다. 과잉 시약을 배출하고 멤브레인의 화학발광 및 비색 사진을 찍습니다.
후자를 단백질 밴드와 함께 보려면 사진을 결합하십시오. 비텔로제닌 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석은 벼와 곤충의 침샘을 먹이는 데 약 220킬로달톤의 특이적이고 예상되는 밴드를 보여주었습니다. 대조적으로, 비섭식 식물에서는 밴드가 관찰되지 않았으며, 이는 비텔로제닌이 타액 단백질로서 식물 숙주에서 방출되었음을 나타냅니다.
벼 왜성 바이러스 P8 단백질의 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석은 먹이 식물과 독성 곤충 사체에서 약 46킬로달톤의 특이적이고 예상되는 밴드를 보여주었습니다. 대조적으로, 비사료 식물과 독성이 없는 딱정벌레 몸체에서는 띠가 관찰되지 않았으며, 이는 사료 공급 식물에서도 바이러스 단백질이 검출될 수 있음을 증명했습니다. 딱정벌레의 바이러스 로딩, 검출 타이밍 및 복제는 이 프로토콜을 수행하는 동안 고려되어야 합니다.
이 방법은 아르보 바이러스를 전염시키는 모기를 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.
