이 방법은 식물 병원체에 의해 분비된 RNA 침묵 억제제를 검열하는 방법에 대한 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 RNA 침묵 억제제 식별에 대한 신속하고 정확하며 광범위한 스크리닝 분석법을 제공하는 것입니다. 20분 동안 120도에서 50%의 토탄 이끼, 30%의 펄라이트, 20%의 버미쿨라이트 및 오토클레이브로 구성된 포팅 토양 믹스를 준비합니다.
오토클레이브 토양 믹스를 식물 비료 용액과 리터당 1그램에 담그고 더 큰 트레이에 저장된 작은 냄비에 서브패키지로 넣습니다. 니코티아나 베타미안나 16c의 한두 씨앗을 각 냄비의 토양 표면에 뿌리세요. 트레이를 플라스틱 돔으로 덮고 씨앗이 발아하도록 합니다.
트레이를 23~25도, 상대 습도 50~60%, 장시간 광등도의 온도 조절된 성장 챔버 아래에 놓습니다. 3~4일 후에 씨앗이 발아됩니다. 플라스틱 돔을 벗고 발아 단계에 사용되는 것과 동일한 조건에서 모종이 성장할 수 있도록 하십시오.
2~3일마다 적당량을 추가하여 토양을 촉촉하게 유지하지만 담그지 않도록 합니다. 10일마다 비료를 추가하여 추가 성장을 촉진합니다. 니코티아나 베타미안아나 16c 식물을 정상적인 조건에서 유지하면 식물이 눈에 보이는 축또는 꽃봉오리가없는 적어도 5 개의 완전한 진정한 잎을 가지고 잎은 건강한 녹색 모양을 가지고 있습니다.
전신 RNA 침묵 분석에 10-14일 된 니코티아나 벳타미안16c 식물을 사용하고 현지 RNA 침묵 분석에 니코티아나 벳하미안나 16c의 3~4주 된 잎을 사용하십시오. 팁을 사용하여 LB 플레이트에서 양성 식민지를 선택하고 셀을 LB 배지 5밀리리터를 포함하는 유리 튜브에 밀리리터 카나마이신 당 50 마이크로그램과 밀리리터 리팜피신 당 50 마이크로그램을 함유한 유리 튜브로 접종하십시오. 24 ~48 시간 동안 200 RPM에서 흔들어 30섭씨에서 세포를 성장시다.
배양금 100마이크로리터를 동일한 항생제로 보충한 LB 배지 5밀리리터, pH 5.6의 밀리모어 MES 10개, 마이크로몰라 AS 20개소로 이송한다. 16~20시간 동안 200RPM에서 30도에서 박테리아를 성장시다. 세포를 4, 000배에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 10 밀리머 마그네슘 염화물 완충제의 두 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다.
항생제의 완전한 제거를 보장하기 위해 세척을 반복합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 아그로박테리움 배양의 밀도를 결정한다. 10 밀리머마그네슘 염화물 완충제로 세포 배양을 1.5 ~2.0의 OD 600으로 조정한다.
최종 현탁액 배양에 pH 5.6 및 150 마이크로몰러 AS에 10 밀리모어 MES를 추가하고 흔들림없이 적어도 3 시간 동안 실온에서 세포를 배양합니다. 35S 녹색 형광 단백질을 함유한 Agrobacterium 배양의 동일한 볼륨을 35S 오이 모자이크 바이러스 억제기 2b, 퍼티티 이펙터 또는 빈 벡터를 함유한 Agrobacterium 배양과 혼합합니다. 1 밀리리터 바늘없는 주사기를 사용하여 니코티아나 벳타미안 16c 잎의 축축 측면에 혼합 된 Agrobacterium 현탁액에 신중하고 천천히 침투합니다.
연조직 물티슈로 잎에서 남은 세균 현탁액을 제거하고 마커 펜으로 침투패치의 여백을 동그라미로 만듭니다. 3~4일 후, 긴 파 자외선 램프를 사용하여 잎의 침투 패치에서 GFP 형광을 시각적으로 감지합니다. 2 주 후 침투, 전신 RNA 침묵에 대 한 전체 식물의 새로 성장 된 잎을 감지 하는 램프를 사용 하 여.
4~7일 후 잎 조직에서 총 RNA를 분리하려면 침투한 니코티아나 베타미안나 16c 패치로부터 잎 조직을 박격포로 수집한다. 액체 질소를 박격포에 넣고 조직을 연삭 막대로 미세 한 분말로 갈아서 분말을 멸균 2 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 즉시 RNA 격리 시약을 100 밀리리터 당 1밀리리터의 부피에 후드의 샘플 튜브에 추가하고, 소용돌이를 적극적으로 균일하게 하고, 실온에서 5분 동안 배양한다.
RNA 격리 시약 1밀리리터당 200 마이크로리터의 부피에 클로로폼을 후드의 각 튜브에 넣고 15초 동안 격렬하게 흔들고 실온에서 5분간 배양합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 배 g에서 동종. 상체를 새로운 RNase 가 없는 튜브로 옮기고 펠릿을 폐기합니다.
상체에 0.7부분량의 이소프로판올을 넣고 여러 번 부드럽게 반전시키고 실온에서 10분 동안 혼합물을 배양합니다. RNA 펠릿을 12, 000배 g에서 섭씨 4도에서 15분간 경전적으로 침전시합니다. 상부체를 폐기합니다.
펠릿을 70% 에탄올로 씻고 후드에 펠릿을 건조시키십시오. RNA를 다이틸 파이로카보네이트처리수에 10~20분 동안 섭씨 65도의 수조로 배양하여 용해하십시오. GFP 메신저 RNA 수준의 북부 블롯 분석을 수행하기 위해 1X MOPS 실행 버퍼에서 1.2%포름알데히드 분해 식 아가로즈 젤을 준비한다.
RNA를 RNA 로딩 염료와 1대 1로 혼합하고 10분 동안 65도에서 잠복하여 RNA를 변성시한다. 즉시 1 분 동안 얼음에 변성 샘플을 냉각. 파이펫을 사용하면 RNA가 잘 분리될 때까지 100볼트에서 젤 및 감전의 우물에 샘플을 50분 간 적재합니다.
포름알데히드를 제거하기 위해 20배 식염수 나트륨 완충제로 젤을 헹구는다. 20배 식염수 나트륨 구연산 버퍼, 종이 타월 1층, 젖은 Whatman 종이 2층, 젤 1층, 나일론 막 1층, 젖은 Whatman 종이 2층, 마른 Whatman 종이 2층, 유리 판 1개 및 무게를 설정하여 하룻밤 사이에 모세관 이송을 수행합니다. 아침에, 젤내의 RNA는 나일론 막으로 옮겨집니다.
구연산 나트륨 2X에 멤브레인을 담그고 젖은 멤브레인을 UV 교차 링크에 노출시킴으로써 RNA를 막에 고정시킵니다. 원고에 따라 진행합니다. 3~4주 된 니코티아나 베타미안나 16c 식물의 완전히 발달된 잎은 35S GFP를 운반하는 아그로바테리움 혼합물로 패치에 공동 침투했습니다.
4일 후 침투후, 침투된 부위의 GFP 형광은 자연광과 긴 파도 자외선 아래에서 이미지화되었다. 북부 블롯은 GFP 메신저 RNA가 35S GFP 플러스 35S GFP 플러스 EV를 표현하는 잎보다 35S GFP 플러스 35S GFP 플러스 35S PSR1을 표현하는 잎에서 더 높은 축적된 것으로 나타났다. 아그로인침 분석은 2주 된 니코티아나 베타미안나 16c 묘목의 잎에 침묵 신호의 확산을 평가하기 위해 수행되었다. 14일 만에 침투 후 EV의 98% 이상이 전신 잎에 명백한 GFP 신호를 보이지 않았습니다.
CMV2b와 PSR1 모두 침묵 신호의 전신 확산을 효율적으로 억제하는 반면. GFP 형광은 공동 침투 식물의 약 80 %에서 관찰되었으며, 새로 나타난 잎에 몇 개의 붉은 정맥만있는 침투 식물의 나머지 20 %에서 관찰되었습니다. 이 기술은 많은 식물 병원체에 의해 분비된 새로운 RNA 침묵 억제제를 확인하는 연구원을 위한 도로를 포장합니다.
식물과 적절한 OD의 조합은이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것입니다. 이 절차에 따라, RNA 침묵 억제제의 기능적 특성화는 이러한 억제제가 숙주 RNA 침묵을 누르는 방법과 출력의 메커니즘을 탐구하기 위해 수행 될 수있다. 식물에 침투할 때 안전 고글을 착용하고 모든 실험 단계에서 라텍스 장갑을 착용하십시오.
