이 프로토콜은 4개의 세포 구획, 즉 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막을 서로 분리하는 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 뿐만 아니라 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 확장 가능하고 재현 가능한 절차입니다. 이 기술의 주요 장점은 세제를 최소한으로 사용하여 4개의 세포 구획을 분리하여 훨씬 더 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 분별 절차를 가능하게 한다는 것입니다.
세포질 단백질 분리를 위해 RPMI 1640에서 U937 세포를 섭씨 37도에서 10% 태아 소 혈청 및 5% 이산화탄소로 성장시켜 최종 총 6x10에서 8번째 세포까지 성장시킵니다. 배양물을 원심분리하고, 세포 펠렛을 실온 PBS에 재현탁시켜 최종 농도인 4 밀리리터당 10 내지 6번째 세포로, 피펫팅하여 덩어리를 분해한다. 2차 원심분리 후, 펠렛을 얼음 냉기 용해 완충액 A에 밀리리터당 2 x 10 내지 7번째 세포 농도로 재현탁시킨다.
다운스트림 핵 단백질 추출을 위해 얼음 위의 원뿔형 튜브에 7.5ml의 세포를 추가하고 원심분리로 나머지 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 밀리리터당 7번째 세포에 2x10의 최종 농도로 세포질 분리 완충액에 재현탁하고, 덩어리를 분해하기 위해 부드럽게 피펫팅한 다음, 종단 간 회전과 함께 섭씨 4도에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 옮깁니다.
상청액을 원심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다. 원심분리 후, 상청액을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 펠릿이 관찰되지 않을 때까지 원심분리 순서를 반복한다. 샘플에 파편이 없으면 세포질 분획 함유 상청액을 섭씨 4도에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
이어서 용해 완충액 A에 저장된 세포 펠렛을 밀리리터당 4 x 10 내지 6 세포의 최종 농도가 되도록 재현탁시킨다. 세포 균질화를 위해 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 폐기하여 과도한 digitonin 및 수축기 오염 물질을 제거합니다. 펠렛을 얼음 위에서 30분 동안 6번째 세포 밀리리터당 10 내지 4의 최종 농도로 빙냉 세포 균질화 완충액에 재현탁시킨다.
한편, 비드 기반 기계적 용해의 경우 얼음 위의 50밀리리터 스커트 튜브에 15밀리리터의 용해 완충액 B에 미리 세척된 스테인리스 스틸 3.2mm 비드 30g을 추가하여 냉각합니다. 배양이 끝나면 스커트 튜브의 완충액을 세포 현탁액으로 교체하고 세포를 속도 8로 5 분 동안 혼합합니다. 용해 후, 균질 액을 깨끗한 튜브로 옮긴다.
균질 액을 원심 분리한 다음 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 샘플에서 남아 있는 파편을 제거하려면 지시된 대로 균질액을 3회 원심분리하고 각 원심분리 후 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막 원심분리 후, 미토콘드리아 분획을 분리하기 위해, 원심분리를 위해 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다.
원심분리 후, 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 미토콘드리아 분획 함유 펠렛을 얼음 위에 놓습니다. 막 분획을 분리하기 위해, 수집된 상등액을 원심분리하고, 상층액을 버린 후 막 분획 함유 조질 펠렛을 얼음 위에 놓았다. 등핵 밀도 구배 정제의 경우, 미토콘드리아 및 막 분획 펠릿을 200 마이크로리터의 용해 완충액 B 및 1.8 밀리리터의 요오드산올에 재현탁시킨다.
각 샘플에 대해 불연속 요오드 요오드 구배를 생성하려면 먼저 샘플 당 1 개의 8 밀리리터 개방형 얇은 벽의 초 원심 분리 튜브의 바닥에 15 % 요오드 산올 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 각 튜브의 15 % 요오드 산올 층 아래에 20 % 요오드 산올 1 밀리리터, 25 % 요오드 산올 1 밀리리터, 30 % 요오드 산올 1 밀리리터 및 35 % 요오드 잔올 1 밀리리터를 순차적으로 밑받침합니다. 한 그래디언트의 바닥층 아래에 2밀리리터의 미토콘드리아 펠릿 현탁액을 추가하고 두 번째 그래디언트의 바닥층 아래에 2밀리리터의 조막 펠릿 현탁액을 추가합니다.
밀도 구배 원심 분리로 미토콘드리아 및 막 분획을 정제하기 전에 각 그래디언트의 상단에 10 % 요오드 산올 1 밀리리터를 조심스럽게 층화하고 필요에 따라 10 % 요오드 사놀을 첨가하여 서로 10 마이크로 그램 내에서 튜브의 균형을 맞 춥니 다. 분리가 끝나면 바늘을 사용하여 얇은 벽 튜브의 측면을 뚫어 각 샘플에서 보이는 밴드를 수집합니다. 핵 단백질 분리를 위해, 용해 완충액 A에 현탁된 세포의 7.5 밀리리터 분취량을 원심분리하고, 피펫팅 및 와동을 사용하여 800 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 가용화 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.
현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 배양하여 혈장과 세포 기관 막을 파괴하고 핵 단백질을 보호합니다. 배양이 끝나면 세포 현탁액을 원심분리하고 벤조나제 마이크로리터당 1단위가 보충된 800마이크로리터의 얼음처럼 차가운 핵용해 완충액에 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. 혼합물을 섭씨 4도의 끝 대 끝 회전기에서 배양하여 핵막을 파괴합니다.
30 분 후, 핵산을 전단하기 위해 펄스 사이에 5 초 동안 일시 중지하면서 20 % 전력에서 5 초 동안 혼합물을 3 번 초음파 처리하십시오. 마지막 초음파 처리 후, 균질 액을 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 핵 분획으로 상청액을 수집합니다. 밀도 구배 정제 후 각각의 분획의 웨스턴 블롯은 25 및 30% 요오드산올 층에 대한 미토콘드리아 분획의 국재화, 및 막 분획의 10 및 15% 요오드산올 층에 대한 국재화를 보여줍니다.
서양 혈액 분석은 또한 분리 된 각 샘플이 순수하고 세포의 다른 부분의 단백질에 의한 오염이 없음을 확인합니다. 또한, 각 시료의 밴드 강도에 대한 농도계 분석은 데이터의 재현성 및 통계적 유의성을 확인한다. 분획을 부적절하게 실행하면 세포 구성 요소가 교차 오염될 수 있습니다.
예를 들어, 세포질 분획에서 히스톤 H3의 농도가 높으면 세포질 분획의 부적절한 정화로 인한 것일 수 있습니다. 등핵 밀도 정제 동안 실패는 막 분획의 오염을 초래할 수 있다. 서양 혈액 분석 전에 단백질 정량 분석을 수행하여 분획에 실제로 단백질이 포함되어 있는지 확인하여 단백질 양을 기반으로 겔 로딩을 허용하고 절차가 적절하게 실행되었는지 확인하는 것이 유용할 수 있습니다.
세포질 분획에 펠릿이 포함되어 있지 않은 것이 중요합니다. 웨스턴 블롯 또는 ELISA는 특정 조건에서 다른 단백질의 세포 내 위치를 분석 할 수 있도록이 절차에 따라 수행 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 고혈당 상태에서 다양한 세포 사멸 요인의 인신 매매를 분석 할 수있었습니다.
그래서 우리에게 이것은 세포 사멸에서 괴사로의 고혈당 전환 메커니즘을 밝히는 데 도움이되었습니다.
