이 프로토콜은 마우스 배아가 발달할 때 이미징을 허용합니다. 이를 통해 초기 심장 발생을 자세히 연구할 수 있습니다. 가짜 배아의 정지 이미지를 찍는 것과 마찬가지로 라이브 이미징은 배아 발달의 역동적인 과정을 연구할 수 있는 완전한 액세스를 제공합니다.
생활 영상에 필요한 기술은 텍스트 전용 출판물로는 파악하기 어렵습니다. 다른 사람이 하는 것을 보는 것은 배우는 것이 필수적입니다. 시작하려면 1cm 길이의 텅스텐 와이어 조각을 자르고 와이어 끝을 포화 질산 나트륨 용액에 담그면 직경이 0.02-0.05mm로 날카롭게됩니다.
팔꿈치 유리 모세관을 준비하려면 표준 1mm 유리 모세관의 중간점을 분젠 라이터 위에 3-6초 동안 놓고 모세관이 얇고 유연해질 때까지 양쪽 끝에서 천천히 당깁니다. 그런 다음 모세관을 반으로 나누고 짧게 가열하여 끝에서 2cm 정도 90도 구부러지도록 합니다. 길이 약 7mm, 너비 4mm, 두께 2mm의 폴리메틸 메타크릴레이트 조각을 보았습니다.
벤치 바이스를 사용하여 메타크릴레이트 조각을 잡은 다음 전체 조각을 가로로 맞춤형 구멍을 뚫습니다. 낮지만 일정한 압력을 가하면서 드릴을 천천히 돌립니다. 미세한 사용 file 홀더의 가장자리를 매끄럽게 하고 크기를 조정합니다.
또한 배아 위치 지정을 용이하게 하기 위해 홀더의 가장자리에 완만한 경사를 만듭니다. 완성 된 홀더를 증류수가 담긴 접시에 담아 헹굽니다. 실체 현미경으로 홀더를 확인하여 구멍에 드릴링 먼지가 있는지 확인하십시오.
먼지가 있으면 텅스텐 바늘을 사용하여 제거하십시오. 홀더를 살균하려면 증류수로 가득 찬 원추형 튜브에 넣고 최소 20와트 출력으로 20분 동안 초음파 처리합니다. 안락사된 배아 6.75일째 내지 7.5일째 임신한 마우스로부터 자궁을 추출하여 건조하고 깨끗한 종이 물티슈 위에 올려 놓는다.
그런 다음 자궁을 잘라내어 가위 끝을 중간 쪽에서 삽입하고 칼날을 따라 밀어 탈락을 노출시킨 다음 해부 매체로 옮깁니다. 배아를 해부하여 외배반 원뿔을 그대로 유지하십시오. 그런 다음 Reichter의 막을 떼어내고 그 일부를 여분의 배아 영역에 남깁니다.
해부 매체를 따뜻하게 유지하려면 10분마다 교체하십시오. 또한, 3-4 개의 그룹으로 decidui를 해부하고 나머지는 섭씨 37도 욕조에 놓인 해부 매체에 보관합니다. 해부 된 배아를 즉시 배양 배지에 넣으십시오.
형광 실체현미경을 이용하여 원하는 형광 특징을 가진 수정란을 선택하고 이를 세포배양 배양기에서 배양액이 들어있는 튜브에 넣고 영상화 전에 2시간 동안 회수한다. 컴퓨터, 소프트웨어 및 레이저를 포함한 모든 현미경 구성 요소를 켠 후 이산화탄소 컨트롤러를 켜고 7%유리 덮개 슬립 바닥이 있는 35mm 접시에 고진공 실리콘 그리스 한 방울을 떨어뜨립니다. 홀더를 드롭 위에 놓고 부드럽게 눌러 고정합니다.
배아 장착을 위해 2-3 개의 배아를 인큐베이터에서 홀더가있는 접시로 옮깁니다. 한 쌍의 집게와 테이퍼 텅스텐 바늘을 사용하여 배아를 구멍에 넣습니다. 바늘을 사용하여 배아를 외태반 원뿔로 걸고 크기에 맞는 구멍에 삽입합니다.
배아와 홀더가 들어 있는 접시를 현미경 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 중간 대물렌즈 계면에 액체 반월판이 형성될 때까지 대물렌즈를 내립니다. 배아에 초점을 맞춘 후 배양 챔버를 장착하고 테이프를 사용하여 대물렌즈 주위에 밀봉합니다.
현미경 제어 소프트웨어에서 실시간 캡처를 사용하여 레이저 출력과 게인 레벨을 조정합니다. 그런 다음 대물렌즈에 천천히 떨어뜨려 파라핀 오일로 매체를 덮습니다. 타임랩스 녹화를 설정합니다.
스택 사이에 3-5미크론 Z 공간을 두고 5-10분 간격을 설정합니다. 배아 성장을 예상하기 위해 Z-Stack 위에 빈 공간을 남겨 둡니다. 최소 50 미크론, 매 시간마다 30 미크론을 추가하면 인수가 감독되지 않습니다.
자동 저장 옵션을 활성화하면 컴퓨터에서 획득을 감독할 수 있으므로 필요한 경우 초점 내의 관심 영역에 맞게 Z-스택 크기를 조정할 수 있습니다. 다광자 이미징에 의한 살아있는 전신 배아 심장 발달이 표시됩니다. 배아 7.5일째에 정맥 형광이 신경 외배엽 전체에 존재하며, 내장 및 여분의 배아 중배엽에 몇 개의 양성 핵이 있습니다.
4시간 후, 내피 전구체는 정맥을 활성화하고 조립되어 심내막관과 기저 대동맥을 형성하고, 7시간 후에는 밀폐된 구조가 됩니다. Reichter의 멤브레인을 제거할 때 주의하십시오. 그것은 특히 prevacillation 단계에서 배아에 실제로 붙어있을 수 있습니다.
제거하는 동안 여분의 배아 부위로 막을 꼬집어 보십시오.
