이 방법은 연구 또는 산업에서 응용 프로그램에 대한 관심의 재조합 RNA의 큰 금액을 생산하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 재조합 RNA가 쉽게 확장될 수 있는 저렴한 공정에서 대장균에서 생산된다는 것입니다. 중요한 것은, RNA는 동질성에 대한 정제를 용이하게 하는 원형 RNA 비계에서 생산된다.
DNA 또는 단백질과는 대조적으로, 관심있는 RNA는 쉽게 생체 공장 시스템, 이러한 대장균 배양에서 다량에서 생산되지 않습니다. 우리의 방법은 매우 안정적인 원형 비계에 삽입된 관심의 RNA의 공동 발현을 기반으로 하고 RNA 순환화를 중재하는 리구아제를 적용한다. 원형 RNA 스캐폴드는 특허받은 비로이드로부터 유래한다.
Viroids는 상대적으로 작은, 비 코일, 일부 높은 식물에 전염 하는 높은 기본 페어링 원형 RNA. 우리는 일반 실험실 조건에서 세균 배양리터 당 재조합 RNA의 수십 밀리그램을 생산할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR로 cDNA를 증폭합니다.
다음으로, 플라스미드 pLELVd-BZB의 100 나노그램을 0.5 밀리리터 튜브에 추가합니다. 타입 IIS 제한 효소 BpiI의 10 U를 추가하고 20 마이크로 리터 반응을 만들기 위하여 완충 G의 충분한. 플라스미드를 소화하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
그 후, 전기전구에 의한 PCR 및 소화 제품을 TAE 완충제에서 1% 아가로즈 젤로 분리한다. 밀리리터당 0.5 마이크로그램의 농도로 200 밀리리터 에티듐 브로마이드에서 젤을 흔들어 서 젤을 얼룩지게 합니다. UV 트랜틸루미네이터를 사용하여 DNA를 시각화합니다.
메스를 사용하여 증폭된 cDNA 및 BpiI 소화 플라스미드에 해당하는 밴드를 잘라냅니다. 실리카 젤 컬럼을 사용하여 젤 조각에서 DNA를 엘테합니다. 분광측정 분석을 통해 DNA의 농도를 정량화한다.
증폭된 cDNA와 소화된 플라스미드를 사용하여 깁슨 어셈블리 반응을 설정합니다. 1 시간 동안 섭씨 50도에서 배양하십시오. 그런 다음 실리카 젤 컬럼을 사용하여 반응을 정화합니다.
유능한 E.coli DH5-알파 세포를 전기화 한 후 여러 개의 흰색 식민지를 선택하고 액체 LB 배지로 옮기습니다. 하룻밤 사이에 식민지를 섭씨 37도에서 키우겠습니다. 다음으로, 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 정화하고, TAE 버퍼의 1% 아가로즈 젤로 전기전도로 크기를 분석합니다.
첫째, 선택된 대장균 균주를 관심의 RNA및 플라스미드 P15LTRNISM에 대응하는 cDNA를 포함하는 pLELVd-BZB 유도체를 모두 사용하여 원간 tRNA 리구아제를 공동 발현한다. SOC 액체 배지를 전기기큐벳으로 이송하여 세포를 회수하고, 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 그런 다음, 밀리리터 암피실린 당 50 마이크로그램, 밀리리터 클로람페니콜 당 34 마이크로그램을 함유한 LB 고체 배지에 박테리아를 플레이트.
하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오. 다음 날, 액체 결핵 매체의 250 밀리리터를 추가, 포함 50 밀리리터 암피실린 당 마이크로 그램, 그리고 34 밀리리터 클로람페니콜 당 마이크로 그램, 한 리터 당황 에를렌 마이어 플라스크에. 배양 된 대장균을 검색 한 다음 식민지를 선택하고 플라스크에서 매체를 접종하십시오.
박테리아를 수확하기 전에 180 RPM에서 180 RPM에서 활발한 흔들림으로 섭씨 37도에서 배양하십시오. 수확한 E.Coli 배양을 250밀리리터 원심분리기 병에 붓고 14, 000 G에서 10분간 세포를 회전시합니다. 상체를 버리고 30 밀리리터의 물에 세포를 다시 중단하십시오.
이 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 이전 조건을 사용하여 세포를 다시 회전시합니다. 상체를 버리고 세포 펠릿에 크로마토그래피 버퍼 10 밀리리터를 추가합니다. 소용돌이버퍼의 셀을 다시 일시 중단합니다.
페놀의 부피를 1부더라: 클로로폼과 소용돌이를 적극적으로 추가하여 세포를 깨뜨린다. 그런 다음 12, 000 G에서 원심분리기를 10분 동안 사용할 수 있습니다. 수성 상회복, 클로로폼 1부, 소용돌이를 적극적으로 추가한다.
12, 000 G의 원심분리기는 10분 동안. 그 후, 45마이크로미터 주사기 필터를 통해 RNA 제제를 필터링한다. 액체 크로마토그래피 시스템에 연결된 1밀리리터 디틸 에탄올 아민 컬럼을 사용하여 RNA를 정화합니다.
유량을 분당 1밀리리터로 조정하고 크로마토그래피 버퍼 10밀리리터로 컬럼을 상형화합니다. 그런 다음 샘플을 로드하고 크로마토그래피 버퍼 10 밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 용출 완충제의 20 밀리리터로 RNA를 엘테우고, 1밀리리터 알리쿼트를 수집합니다.
2차원 폴리아크릴아미드 젤 전기포레시스를 사용하여 원형 RNA를 선형 과대 분리합니다. 먼저 TBE 버퍼에서 5% 폴리아크릴아미드 젤을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 8개의 어금니 우레아를 함유한다. RNA 제제의 마이크로리터 20개를 한 부적버퍼로 혼합합니다.
난방 블록에서 섭씨 95도에서 1.5분 동안 배양한 다음 얼음위를 식힙니다. 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 적재하고 겔 치수에 적합한 조건에서 전기포고를 실행한다. 그 후, 젤을 밀리리터 에티듐 브로마이드당 0.5 마이크로그램으로 15분간 염색합니다.
스테인드 젤을 물로 씻은 다음 UV 빛 아래에서 RNA를 시각화합니다. 다른 cDN이 삽입되는 여러 재조합 플라스미드의 전기 전광 분석은 pLELVd-BZB에 비해 다른 마이그레이션을 보여줍니다. pLELVd-BZB는 관심있는 RNA에 대응하는 cDNA로 대체되는 lacZ 마커를 포함하므로 마이그레이션은 삽입 된 cDNA의 크기에 따라 다르지만 재조합 플라스미드는 일반적으로 제어 플라스미드보다 빠르게 마이그레이션됩니다.
공동 전극성 세균 배양에서 재조합 RNA의 생산은 세포를 파괴하고 PAGE를 분해하여 RNA를 분석함으로써 모니터링된다. 관심있는 다른 RNA가 삽입 된 빈 ELVd 및 키메라 ELVd 형태에 해당하는 강력한 밴드를 볼 수 있습니다. 흥미롭게도, 재조합 RNA의 주요 분수는 원형 형태로 볼 수 있습니다.
주요 분획의 원형은 높고 낮은 이온 강도에서 데마포링 조건하에서 두 개의 PAGEs의 조합을 사용하여 관찰된다. RNA 제제는 애니온 교환 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 여기에서 볼 수 있듯이, 대장균 RNA는 낮은 이온 강도에서 효율적으로 유지되고, 그 후에 높은 이온 강도에서 용출되고, RNA의 대부분은 분수 2 및 3에서 집합되는.
재조합 RNA는 2-D 전기포진에 의해 균질성으로 더 정제될 수 있다. 이 프로토콜을 통해 대장균에서 다량의 재조합 RNA를 쉽게 생산하고 최종 제품의 순환성 덕분에 균일성으로 정제할 수 있습니다. 식물 viroid에서 파생 된 원형 RNA 스캐폴드에 내장 된 관심 결과의 RNA를 기억하십시오.
두 moieties를 분리하려는 경우, 작은 RNA가 더 큰 것보다 더 높은 양으로 생산될 가능성이 높기 때문에 리보지메, DNAzymes 또는 RNase H.와 같은 표준 전략을 사용해야 합니다. 더 큰 규모의 표현의 경우, 박테리아를 수확하는 최적의 시간은 E.Coli 균주, 배양 배지 및 성장하는 조건을 포함한 많은 요인에 달려 있다는 것을 고려하십시오. 특정 조건에서 최적의 생산 창을 찾기 위해 예비 시간 과정 분석방법을 권장합니다.
재조합 RNA는 일시적으로 세균 세포에 축적되고, 그(것)들은 완전히 늦게 성장하는 단계에서 사라다는 것을 기억하십시오.
