이 절차의 목적은 신호 기능의 기계론적 기초를 이해하고 합리적인 약물 설계를 위한 플랫폼을 구축하기 위해 인간 IKK1-알파의 생산, 결정화 및 구조적 결정에 대한 지침을 제공하는 것입니다. 이 방법은 연구원이 면역 신호 분야의 주요 쿼리에 대한 답변을 제공하는 IKK1의 구조를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 결정화에 다소 내화성인 IKK 단백질의 결정을 얻는 간소화된 경로를 설명하고 구조물을 결정하는 병목 현상을 극복하는 데 있어 다양한 중요한 정보를 제공합니다.
일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 가용성, 잘 행동한 단백질의 밀리그램 양을 생성하기 때문에, 곤충 세포에 있는 그것의 발현을 필요로 하고, 결정화는 조건의 단지 높게 좁은 창에서 행해질 수 있기 때문에 투쟁할 것입니다. IKK1의 구조를 결정하는 데 사용되는 분자 교체 절차는 또한 매우 까다로울 수 있으며, 특히 적절한 검색 모델이 없는 경우 많은 IKK1 분자를 함유하는 비대칭 단위의 부위가 아닌 결정의 편향 특성이 좋지 않기 때문에 매우 까다로울 수 있다. 절차를 시연하는 것은 카일 슈메이트와 손지알라 호치키스, 내 실험실에서 학생들이 될 것입니다.
첫날, Sf9 세포는 Sf903 곤충 세포 배지의 2밀리리터로, 6웰 플레이트의 각 우물에서 27°C의 배양합니다. 그들은 신선한 매체에 희석하여, 약 6 배 10에서 5의 밀도로, 신선한 매체에 희석하여 현탁액에 밀리리터 당 6 개의 세포에 2 ~ 3 배 10의 밀도에 도달 할 때 세포를 통과. 둘째 날, SF9 경질 시약의 8마이크로리터를 SF-903 또는 그레이스의 곤충 매체 100마이크로리터로 희석시.
그런 다음 혼합물을 간략하게 소용돌이시다. 별도의 튜브에서 키트 정제 재조합 바미드 1마이크로그램을 동일한 배지의 100 마이크로리터에 희석시켰다. 희석 된 DNA와 경질 시약을 결합합니다.
실온에서 15~30분 동안 배양한 후, 우물에서 배지를 제거합니다. 그런 다음 신선한 매체의 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 희석된 DNA 경전 시약 혼합물을 세포에 드롭와이즈로 추가하여, 부착 세포를 배출하지 않도록 낙하 크기를 조정한다.
6 시간 후, 세포의 상단에 신선한 배지의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 27섭씨에서 세포를 배양하고, 바이러스 감염의 징후는 12시간마다 주기적으로 우물을 검사합니다. 5일째에, 세포를 포함하는 배지를 제거, 60 72 시간 감염 후.
배지를 튜브로 옮긴 후 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리기를 사용한다. 완료되면 P1 바이러스 스택인 상체를 저장합니다. 첫날, 이전에 준비된 His-IKK1 세포 펠릿을 40 밀리리터의 용해 완충제에서 재보중단합니다.
세포 현탁액을 얼음 위에 놓고 초음파 처리로 세포를 60%에서 70%의 듀티 사이클로, 1분 이상 간격으로 30초 지속시간의 5~10펄스를 제거합니다. 섭씨 4도에서 45분 동안 28g, 000g보다 크거나 동일한 원심분리로 용액을 명확히 하십시오. 텍스트 프로토콜에 따르면 니켈-NTA 아가로즈 수지를 준비한 후, 용출 버퍼 20밀리리터를 사용하여 중력 흐름 하에서 그의 태그가 붙은 IKK1 알파 단백질을 엘테.
1~1.5밀리리터 분획을 수집합니다. 단백질을 포함하는 분획을 결합한 후에, 4섭씨에서 하룻밤 동안 TEV 프로테아제와 견본을 소화합니다. 둘째 날 아침, 염화 마그네슘, 베타 글리세로포산염, 불소나트륨, 나트륨 오르토나데이트가 27도에서 1시간 동안 ATP 1밀리머로 단백질을 배양합니다.
인큐베이션에 이어 0.45 미크론 필터를 통해 단백질 용액을 필터링합니다. 그런 다음 자동화된 액체 크로마토그래피 시스템에 부착된 120 밀리리터 전소 크기 배제 컬럼에 샘플의 약 6밀리리터를 적재합니다. 평형 후, 분당 1 밀리리터의 유속도로 크기 배제 크로마토그래피를 실행하고 2 밀리리터 분획을 수집합니다.
실행 하는 동안, 280 및 254 나노 미터에서 용출을 모니터링. 순수한 분획을 당긴 후 제조업체의 지시에 따라 30킬로달톤, 분자량 컷오프 원심 농축기에 농축합니다. 그런 다음 농축 된 단백질의 25 마이크로 리터 알리쿼트와 액체 질소의 플래시 동결을 분배합니다.
로봇을 사용하여 결정화 시약의 파이펫 80~ 100 마이크로리터가 96웰 플레이트의 저수지로 들어갑니다. 결정화 로봇을 사용하여 IKK1의 0.2~ 0.25 마이크로리터와 동일한 양의 저수지 용액을 사용하여 억제제 복합체를 분배하고 혼합합니다. 방울을 설정 한 직후, 증발을 피하기 위해 광학적으로 명확한 필름으로 각 플레이트를 밀봉하십시오.
한 접시를 섭씨 18도, 다른 접시는 차가운 방에서 섭씨 4도에 배양합니다. 편광기가 있는 스테레오 현미경을 사용하여 매일, 첫 7일 동안, 그리고 더 긴 간격으로 결정의 모양을 확인합니다. 이전에 설명한 바와 같이 IKK1 및 억제제 복합체를 준비한 후, 24웰 플레이트의 각 웰에 웰 솔루션을 전달한다.
깨끗한 유리 커버슬립에 1~1.5 마이크로리터의 웰 액액을 놓습니다. IKK1과 그 억제제 복합체를 유리 커버슬립에 넣고 3~4회 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞는다. 접시의 각 우물의 고리에 그리스를 적용 한 후, 위에 유리 커버 슬립을 켜고 집게와 각각 잘 배치.
그런 다음 유리 커버 슬립을 눌러 우물을 밀봉합니다. 24웰 플레이트의 모든 방울을 설정 한 후, 어둠 속에서 차가운 방에서 배양하십시오. 때때로 외관과 결정의 성장을 위해 현미경의 밑에 방울을 확인하십시오.
크리스탈 성장이 완료되면 크리스탈이 들어있는 유리 커버 슬립을 부드럽게 제거하고 크리스탈 드롭이 위쪽으로 향하여 단단한 표면에 놓습니다. 10 마이크로리터의 저저온 A 용액을 드롭 위에 부드럽게 넣고 파이프팅으로 부드럽게 섞어 크리스탈이 닿지 않도록 합니다. 현미경을 사용하여 결정에서 액체를 천천히 제거하고 용액의 약 5 ~ 8 마이크로 리터를 유지하십시오.
2.5~4마이크로리터의 저온 B 용액을 드롭에 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 크리스탈 위에 직접 공기 흐름을 피하기 위해 작은 페트리 접시로 유리 커버 슬립을 덮습니다. 5분을 기다린 후, 적절한 베이스에 장착된 적절한 냉동 루프에서 낙하에서 한 정산을 신중하게 선택합니다.
액상 질소로 수정을 플래시 동결합니다. 그런 다음 싱크로트론에서 X선 회절을 준비할 때까지 데워 플라스크에 액체 질소에 담근 퍽에 냉동 루프가 함유 된 크리스탈을 저장합니다. 여러 개의 다른 IKK1 변종으로 광범위한 시험 후, 결정은 IKK 억제제 XII의 존재에서만 적합한 X 선 특성을 표시 한 잘린 구조로 얻어졌다.
약한 강도의 저해상도 X선 데이터의 결합 효과, IKK1 단조변형 모델의 비대칭 단위 및 변형 변이에 많은 수의 IKK1 분자는 알려진 IKK2 모델에 비해 분자 대체 솔루션인 IKK1을 획득하고 그 구조를 결정하기 가 어려웠습니다. 다른 IKK2 구조는 4개의 다른 이머 모델에서 두 키나아제 도메인의 P578의 알파 탄소 사이의 거리가 39와 61 angstroms 사이에서 다양할 수 있도록 조광 내에서 서로 다른 단조로운 방향을 나타냈다. 고해상도 IKK2 구조를 기반으로 생성될 수 있는 저해상도 극저온 현미경 검사법과 IKK1 도메인의 고정밀 모델때문에 유용한 검색 모델을 얻을 수 있었습니다.
초기 모델은 IKK2 단조량체와 58개의 협소항의 N 단자 개구부를 기준으로 키나아제 도메인의 방향이 24도 회전된 것을 나타냈습니다. 52-angstrom이 열리는 조광기 중 하나를 모델로 사용하여 비대칭 유닛에 6개의 디머가 배치되었습니다. 일단 마스터되면 제대로 수행되는 경우 이 기술을 몇 달 안에 실행할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안, 수용성, 활성 및 잘 행동 한 단백질의 획득이 첫 번째 중요한 단계임을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 IKK1 단백질의 구조를 구체화하고 결정하는 데 성공하기 위해 근면한 세부 사항으로 따라야 하는 모든 단계에 대한 일반적인 이해가 필요합니다. 이 절차를 배우는, 키나제 미토겐 신호에 대한 추가 질문에 대답하기 위하여 또한 결정할 수 있는 그밖 IKK 가족 단백질의 아직도 구조물이 있습니다.
