패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 네이티브 이온 채널 특성을 연구하려면 급성으로 분리된 세포에 접근해야 합니다. 이 프로토콜은 다른 연령대의 제브라 피쉬에서 개별 심혈관 근육 세포에 접근하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 강력하고 간단하며 쉽게 재현 할 수 있으며 상대적으로 높은 수확량과 생존력으로 제브라 피쉬의 심혈관 근육 세포를 원래 상태로 분리합니다.
시작하려면 물고기를 관류 완충액으로 부분적으로 채워진 큰 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 복부 쪽이 해부 범위를 향하도록 지배적이지 않은 손에 물고기를 잡으십시오. 주로 사용하는 손에 가는 집게를 들고 물고기의 가슴 근육과 지느러미를 부드럽게 찢어 심방, 심실 및 동맥 구근을 포함한 심혈관 조직을 드러냅니다.
구근 동맥과 복부 대동맥의 교차 끝에서 구근 동맥을 부드럽게 당깁니다. 집게를 꼬집어 대동맥에서 동맥 구근을 조심스럽게 분리하고 심방의 끝을 수렴하는 여러 정맥 가지에 위치시킵니다. 그런 다음 정맥동에서 심방 끝을 뽑아 심혈관 조직을 신체의 나머지 부분과 분리합니다.
심근 세포를 해부하려면 심방과 심실을 심혈관 조직에서 뽑아 내십시오. 미세한 집게를 사용하여 심실을 부드럽게 찢어 과도한 혈액을 배출하면 심장 조직이 밝은 빨간색에서 옅은 연어 색으로 변할 때 보장 할 수 있습니다. 분리된 아트리움과 심실을 관류 완충액이 포함된 별도의 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 모읍니다.
튜브의 관류 버퍼를 750 마이크로 리터의 소화 버퍼로 교체하십시오. 튜브를 섭씨 37도 및 분당 800 회전으로 열 셰이커에 놓습니다. 조직이 반투명해질 때까지 소화를 허용하십시오.
벤치 탑 미니 원심 분리기에서 조직을 2, 000 배 G에서 3 내지 5 초 동안 부드럽게 회전시켜 소화를 종료하고 상청액 소화 완충액을 750 마이크로 리터의 정지 완충액으로 교체하십시오. 정지 완충액을 500 내지 750 마이크로리터의 관류 완충액으로 부드럽게 교체하고, 세포를 분산시키기 위해 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 30회 분쇄한다. 그런 다음 심실을 부드럽게 분쇄하십시오.
균일한 샘플링을 위해 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킨 후 해당 연구를 위해 한 방울 떨어뜨립니다. 심혈관 조직에서 성인 동맥 구근을 뽑고 S1 완충액이 들어있는 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 5 개의 구근 동맥을 풀링합니다. S1을 400 마이크로 리터의 S2 버퍼로 교체하고 섭씨 37도 및 분당 800 회전의 열 셰이커에서 20 분 동안 구근 동맥의 파파인 소화를 허용합니다.
부분적으로 소화 된 동맥 구근을 1 분 동안 가라 앉히고 S2 상청액을 콜라게나 제가 함유 된 S3 완충액 500 마이크로 리터로 교체하십시오. 섭씨 37도, 분당 800 회전의 열 셰이커에서 조직을 3-5 분 동안 소화하십시오. 벤치 탑 미니 원심 분리기에서 조직을 2, 000 배 G에서 3-5 초 동안 부드럽게 회전시켜 소화를 끝내고 S3 상청액을 500 마이크로 리터의 S1로 교체하십시오. 펠렛 조직을 부드럽게 분쇄하여 혈관 평활근 세포를 분산시킵니다.
분산된 혈관 평활근 세포를 적절한 크기의 유리 커버 슬립에 플레이트화합니다. 셀이 부착될 때까지 커버 슬립을 실온에서 30분 동안 보관하고 다음 6시간 이내에 사용하십시오. 배아를 마취하십시오.
그런 다음 배아를 5 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮겨 농축 한 다음 여분의 배지를 제거합니다. 3 밀리리터의 냉 관류 완충액으로 배아를 두 번 씻은 다음 2 밀리리터의 관류 완충액에 다시 현탁시킵니다. 배아 심장 격리 장치를 사용하여 배아 1 밀리리터를 바늘에 넣고 즉시 튜브로 다시 배출하십시오.
조각난 배아를 깔때기에 놓인 100 마이크로 미터 세포 여과기 체를 통과시킵니다. 여과 된 하트를 다른 5 밀리리터 원심 분리기 튜브에 모으십시오. 여과액을 잘 혼합하고 1밀리리터 분취량을 1.5밀리리터 원심분리 튜브로 분리합니다.
벤치탑 미니원심분리기의 모든 튜브를 5초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 1 밀리리터의 관류 버퍼를 사용하여 튜브에서 펠릿의 연속 재현탁을 수행하십시오. 해당 연구를 위해 한 방울을 추가하기 전에 심장을 위아래로 부드럽게 두 번 피펫팅합니다. 동맥 구근에서 분리 된 세포의 경우 혈관 평활근 세포를 tagln : EGFP 발현으로 확인했습니다.
분리 된 심근 세포에서 ATP에 민감한 칼륨 채널 활성의 기록의 대표적인 흔적이 여기에 표시됩니다. 성공적인 단일 채널 녹음은 배아 심장에서 절제된 패치에서 얻어졌다. 심실 근세포는 안정적인 과분극 막 전위를 나타내었고, 활동 전위는 패치 피펫을 통한 전류 주입을 통해 자극되었습니다.
심방 근세포는 자발적인 활동 전위 발화를 나타내었다. 활동 전위 속성은 여기에 요약되어 있습니다. 심근 세포 해리 중에 완충액을 교체하는 동안 소화 조직이 방해받지 않도록주의해야합니다.
조직 단편화는 피펫 분쇄에 의해서만 수행되어야합니다. 구근 조직의 콜라겐 소화 과정에서 매분마다 부유, 팽창 및 반투명 조직을 검사하십시오. 조직 단편화가 분명해지면 소화를 중단하십시오.
세포가 분리되면 몇 시간 동안 생존 상태를 유지하고 패치 클램프 기술을 사용하여 전기 생리 학적 분석에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 우리가 이러한 제브라 피쉬 조직의 ATP에 민감한 칼륨 채널이 포유류의 칼륨 채널과 본질적으로 동일하다는 것을 보여줄 수있었습니다.
