이 문서의 전반적인 목표는 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포, CSC의 격리, 특성화 및 분화에 대한 프로토콜을 표준화하는 것입니다. 이 방법은 심장 줄기 세포 치료 및 심부전과 같은 심혈관 질환 및 지역 치료 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 기간에 높은 원조와 비용 효과적이라는 것입니다.
프로토콜에 설명된 바와 같이 멸균 된 상태에서 필요한 모든 재료, 계측기 및 격리 버퍼를 준비하여이 실험을 시작합니다. 안락사 마우스의 복부에서 피부를 제거 한 후, 흉부 구멍을 열 멸균 후드 내부의 흉곽을 잘라. 심장을 노출한 다음 1 밀리리터 주사기를 사용하여 심장 근처의 혈액을 제거합니다.
심장 근처의 혈액을 제거하려면 얼음 차가운 PBS로 주변 지역을 씻으하십시오. 외과 가위와 핀셋을 사용하여 심장을 해부하고 10 밀리리터 얼음 차가운 PBS가 들어있는 100 mm 페트리 접시에 놓습니다. 구부러진 생크 집게를 사용하여 심장을 마비시키고 심장 내부의 잔류 혈액을 제거합니다.
4~5개의 고립된 하트를 얼음 차가운 햄의 균형 잡힌 소금 용액 10밀리리터가 들어있는 100밀리리터 페트리 접시로 옮춥니까. 그들을 씻고 심장 안쪽에 잔류 혈액을 제거하기 위해 다시 마음을 망가. 혈액을 완전히 제거하려면 세척 할 때마다 HBSS 용액을 변경하십시오.
각 심장에 집게를 들고 수술용 블레이드를 사용하여 각 심장을 100mm 페트리 접시에 5~7밀리리터를 함유한 페트리 접시에 2~4밀리미터 조각으로 자른다. 완전한 혈액 제거를 보장하기 위해 용액을 자주 변경합니다. 마지막으로 HBSS 솔루션에서 하트를 다진다.
50밀리리터 원원형 튜브에 50밀리리터 원원형 튜브에 배치된 다진 하트를 500회 G, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리한 다음 상퍼를 폐기합니다. 조직을 소화하기 위해 펠릿에 5~6밀리리터, 0.2%의 콜라게나아제 II 용액을 첨가합니다. 45~60분 동안 섭씨 37도에서 셰이커에 튜브를 75회 흔들어 펠릿을 철저히 정지시합니다.
20-30분마다 손으로 튜브를 힘차게 흔들어 서다. 5밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 lysed 조직 믹스를 트리투레이하고, 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 조직 덩어리를 해리시화합니다. 조직의 효소 용액을 중지하려면, lysed 조직의 부피만큼 시판되는 CSC 유지 보수 매체의 2 ~3 배를 추가하십시오.
소화되지 않은 조직 조각을 제거하기 위해 50 밀리리터 원내 튜브에 놓인 100 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 소화된 세포 현탁액을 전달합니다. 세포를 구밀도 원심 분리로 분리하려면 섭씨 37도, 예열된 다각형 및 디아트리조아테 용액을 50밀리리터 원추형 튜브에 추가합니다. 그런 다음 두 솔루션의 혼합을 피하면서 용액에 동일한 양의 여과를 부드럽게 천천히 추가합니다.
45도에서 튜브를 기울여 튜브를 튜브 벽에 기울이면 혼합하지 않고 천천히 다각형 및 나트륨 디아트리조아테 용액위에 여과물을 추가하는 것이 중요합니다. 여과 위에 다각형 및 나트륨 디아트리조아테 용액을 첨가하지 마십시오. 튜브를 스윙 버킷 원심분리기에 매우 천천히 배치하여 솔루션을 방해하지 않도록 합니다.
원심분리기는 2개의 용액을 혼합하지 않도록, 그리고 심장 줄기 세포의 적절한 분리를 위해 낮은 가속 및 감속 속도로 설정된 실온에서 20분 동안 500배 G에서. 원심분리기의 방해 없이 그라데이션 솔루션을 매우 신중하게 넣는 것이 중요합니다. 원심분리기의 가속과 감속은 하나 또는 0과 같은 가장 낮은 속도에 있어야 합니다.
1mm 파이펫을 사용하여 CSC가 함유된 버피 코트를 상부 층에서 15밀리리터 멸균 튜브로 추가 용액으로 전송합니다. 동일한 양의 CSC 유지 보수 매체를 추가하고 제대로 혼합하여 잔류 다당류 및 나트륨 디아트리조아테 용액을 중화시합니다. 원심 분리기는 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 이 서스펜션을 사용한다.
상부체를 폐기합니다. 불완전한 DMEM 솔루션으로 CSC의 세척을 적어도 두 번 반복하십시오. 원심분리기는 섭씨 4도에서 500회 G로 잔류 다각형 및 디아트리조아테 나트륨 용액을 제거합니다.
상체를 제거한 후, 정제된 CSC를 함유한 펠릿을 1밀리리터 CSC 유지 보수 매체로 회수한 다음 세포를 계산합니다. CSC는 0.5%의 섬유네틴을 함유한 0.02%의 젤라틴 용액으로 코팅된 6웰 배양 판에 CSC를 시드하고 완전한 유지 보수 매체의 2밀리리터를 추가합니다. 5%의 CO2에서 섭씨 37도에서 세포를 성장시면 됩니다.
CSC 배양이 합류에 도달하면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포를 새로운 젤라틴 및 섬유넥틴 코팅 플레이트로 이송합니다. 문화권은 P0 CSC를 컨실루까지 5%의 CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도의 완전한 CSC 유지 보수 매체로 전송했습니다. 추가 실험에 사용할 수 있는 P1 CSC를 만들기 위해 새 플레이트로 셀 전송을 반복합니다.
초기 단계에서 CSC 배양을 유지하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 셀을 더 시드합니다. 배양 된 세포를 특성화하기 위해, 형광 현미경의 목표에 플레이트를 포함하는 CSC를 배치합니다. 10배 배율을 사용하여 셀에 초점을 맞춥니다.
세포를 관찰하려면 위상 대비 조리개를 사용하고 객관적인 렌즈를 변경하여 배율을 20배로 늘린 다음 CS를 이미지화합니다. 면역 염색을 수행 한 후, 형광 현미경 아래에 배양 판을 놓습니다. 다른 배율에 세포를 집중하고, 위상 대비 및 상이 다른 여기 필터하에서 세포를 관찰하고, 이미지를 저장합니다.
세포 분화를 위해, 섭씨 37도, 미리 따뜻해지는 CSC 유지 보수 매체의 2밀리리터로 6웰 플레이트에서 CSC를 성장시다. 세포가 80 ~95%의 합류에 도달하면 유지 보수 매체를 섭씨 37도, 미리 따뜻워진 심근세포 분화 매체로 교체하십시오. 섭씨 37도에서 최대 2~3주 동안 5%의 CO2로 배양합니다.
2~3일마다 분화 매체를 변경합니다. 중간 변화 동안, 좋은 배양 조건을 보장하기 위해 현미경으로 세포 형태를 관찰한다. 12일 후, 표준 면역염색 프로토콜에 따라 분화 마커에 대한 세포를 이미지화한다.
2~3일 배양된 CSC는 위상 대비 현미경하에서 관찰될 때 스핀들 모양의 형태를 보여줍니다. 문화의 7 일 후, 그들은 길어지고 형태에 변화를 보여줍니다. 자발성 마커에 대한 면역 염색 후, CSC는 OCT4, SOX2 및 나노그의 발현을 보여줍니다.
또한, CSC는 배양 배지에서 확산되고, 증식 마커 Ki67을 표현한다. CSC의 심장 기원을 특성화하기 위해 심장 마커의 발현을 검사하고 세포는 심장 마커 Sca-1, NKX2.5 및 GATA4에 대해 양성인 것으로 나타났다. 12일 동안 심근세포 분화 배지에서 배양한 후, 차별화된 CSCs는 ACTIN, 및 TROPONIN-I의 심근세포 마커의 발현을 보여준다.
이 절차를 시도하는 동안 그라데이션 솔루션과 여과율을 혼합하지 않는 것이 중요합니다. 가속과 감속을 최저 속도로 설정하는 것도 중요합니다. 누구든지 오염하는 사람은 생물 안전 캐비닛 내부의 모든 세포 격리 공정을 수행하는 것이 좋습니다.
이 절차에 따라, 자기 비드 기반 분리 또는 유동 세포 세포 선별 방법과 같은 다른 방법은 심장 줄기 세포의 균일 한 인구와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다? 심장 줄기 세포의 균열 반경은 큰 마커이며 심근 세포에 대한 차이가 있습니다. 개발 후, 이 기술은 종종 허혈성 심부전의 재생 치료에 중요 할 수있는 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 높은 수율을 심혈관 질환의 분야에서 연구원을위한 길을 열 것입니다.
수술용 블레이드, 표백제 및 DMSO와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 인력 보호 장비인 PPE를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.
