이 작품은 NIH HL109478 (KNF)에 의해 지원되었다. 저자는 분리와 문화 PASMC을 유지 인정하고 그들의 도움을지나 김 조앤 테일러 감사합니다.

노스 웨스턴 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회는이 프로토콜을 승인했다. 1. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 첫째날 <ol><li> 100 ML (최종 농도 = 20 %), 열 비활성화 FBS 5 ML (최종 농도 = 1 %) 페니실린 / 스트렙토 마이신과 믹스 400 ML M199 - 완료 M199 매체를 준비합니다. </li><li> 5 ML (최종 농도 = 1 %) 페니실린 / 스트렙토 마이신과 믹스 500 ML M199 - 혈청 M199 미디어를 준비합니다. </li><li> 믹스 0.05 g 아가 플러스 10 ㎖ 멸균, 혈청 M199 미디어 0.05 g 철 입자 - PA 아가로 오스를 준비합니다. </li><li> 10 ㎖ 멸균, 혈청 M199 미디어 믹스 0.1 g 아가 - 폐 아가로 오스를 준비합니다. </li><li> 살균 필터이 혼합물 후 80 U / ML의 최종 농도에서 살균, 혈청 M199 미디어로 믹스 콜라와 - 콜라게나 제를 준비합니다. </lI&gt; <li> 마우스를 euthanizing하기 전에 미리 모든 장비를 설정합니다. </li><li> 마우스를 euthanizing 바로 전에 끓여 PA 아가 폐 아가를 설정합니다. </li><li> isoflurane을 과다 복용과 마취 항아리에 마우스를 안락사와 isoflurane을과 접촉 마우스 강아지 않도록주의해야합니다. 가장 좋은 세포 수율은 세포 죽음 후에 순환 형성 미세 혈전을 방지하기 위해 사망 직후 수확 할 때 얻을 수있다. </li><li> 마취 항아리에서 마우스를 제거하고 운영위원회에 마우스를 확보하고, 마우스, 악기, 그리고 알코올 장갑을 소독. </li><li> 블레이드 메스를로드하고 목에서 하부 복부에 마우스를 절개. </li><li> 마우스의 왼쪽 복부를 열고, 신장을 노출하고 마우스 그로 인하여 폐의 작은 혈관에 혈전을 방지에게서 피를 뽑다 할 수 있도록 신장 동맥을 잘라. </li><li> 의 마우스의 왼쪽을 따라 잘라 가위를 사용하여흉골은 가슴을 엽니 다. </li><li> 조심스럽게 양쪽에 격막을 절감하고 완전히 흉강을 열고 메스를 사용합니다. 흉강가 열려 개최 집게 나 핀을 사용합니다. </li><li> PA쪽으로 이동 27 G ½ 인치 바늘로 RV 스틱과 폐 (모든 혈액이 폐동맥 순환 밖으로 플러시) 흰색 나타날 때까지 멸균 PBS로 RV / PA / 폐를 붓는다. 이 마우스의 크기에 따라 PBS의 약 3 ~ 5 mL를 취하여 것입니다. 그것은 작은 폐 혈관의 혈전 형성을 방지하기 위해 먼저 세척하는 것이 중요합니다. </li><li> 조심 기관 및 스레드 하나의 봉합 아래를 노출하는 무딘 절개를 사용합니다. </li><li> 지원 기관 아래 작은 집게를 넣고 기관에 24 G의 angiocatheter를 놓습니다. IV를 배치하는 것처럼 angiocatheter를 놓습니다. </li><li> 단계 1.16에 스레드 봉합사 기관에 angiocatheter를 고정합니다. </li><li> 끓는 물에서 끓는 PA 아가을 가지고, 잘 섞어 반전. agaro를 냉각SE 얼음에 소용돌이 약 체온 있습니다. 아가로 오스 솔루션에 남아 있지만 PA의 세포를 손상시킬 수 있도록 뜨거울 수 없습니다해야합니다. </li><li> 27 G ½ 인치 바늘로 RV 스틱과 폐 회색 나타날 때까지 PA 아가와 RV / PA / 폐를 붓는다. 아가로 오스의 혼합물에서 철 입자는 폐 색에서 회색 표시 할 것입니다. 이 마우스의 크기에 따라 PA 아가의 약 3 ~ 5 mL를 취하여 것입니다. 그것은 철기도에 누수가 발생할 수 있습니다 너무 빨리 주사로 천천히하는 것도 중요합니다. </li><li> 끓는 물 폐 아가 아웃을하고 잘 섞어 반전. 그런 다음 얼음에 소용돌이가 약 체온 아가로 오스를 냉각. 아가로 오스 솔루션에 남아 있지만 폐의 세포를 손상시킬 수 있도록 뜨거울 수 없습니다해야합니다. </li><li> 폐 아가을 작성하고 기관에 24 G의 angiocatheter에 주사기를 연결합니다. 완전히 폐를 팽창시키는 기관을 통해 아가로 오스를 주입. 폐 easie 될 것이다R 폐 적절하게 팽창하는 경우 (이후 단계 참조) 말하다. </li><li> 심장 폐 블록을 제거하고 잠수함 그것을 아가로 오스 (~ 5 분) 응고 얼음 차가운 PBS의 25 ML에. 외과 영역을 청소하려면이 시간을 사용합니다. </li><li> 신생아 생쥐 (P7-P21), 최고의 PASMC 수율은​​ 세포의 하나의 일괄 처리로 2 ~ 3 새끼를 결합에서 온다. PASMC 최적의 세포 건강과 성장을 위해 다른 세포와 접촉 할 것을 선호합니다. 하나의 마우스 격리 당 사용되는 경우, 그 세포는 매우 드물다 잘 성장하지 않습니다. 함께 동물, 수확 차가운 심장 - 폐 블럭을 결합하고 모든 심장 - 폐 블럭은 동물에서 제거되고 나면 다음 닦지로 이동합니다. </li><li> 이 시점 이후부터 무균 세포 배양 후드로 이동합니다. </li><li> 10cm 조직 문화 접시의 뚜껑에 냉장 폐를 놓고 조심 심장, 흉선, 기관, 및 폐에서 어떤 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 10cm 조직 문화 접시의 바닥에 폐를 이동약 1 ML 얼음처럼 차가운 멸균 PBS를 추가합니다. </li><li> 2 메스 매우 작은 조각 (1-2 ㎜)로 폐를 말하다. </li><li> 멸균 10 ML 혈청 피펫 해제 팁을 휴식. 피펫 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 폐 슬러리를 다진. 폐 조직의 모든 50 ML 원뿔 튜브에 들어간 것을 보장하기 위해 접시를 씻어 추가 살균 얼음처럼 차가운 PBS를 사용합니다. </li><li> 자석에 50 ML 원뿔 튜브를 놓습니다. 철 함유 조직 자석 옆에 튜브의 측면에 올 때까지 기다립니다. 폐 조직에 철 함유 용기의 비율에 따라 혈관의 일부는 여전히이 시점에서 떠 될 수 있습니다. 그것은 혈관을 포함하는 경우 불분명하기 때문에 PBS 차분히 부동 폐 조직을 대기음하지 않는 것을 시도 해제 대기음. </li><li> 다시 흡입되어 폐 조직의 양을 최소화하기 위해 노력하고, 5 ML 멸균 PBS로 폐 펠릿 배를 씻으십시오. </li><li> 3 ML의 콜라에서 폐 펠렛을 resuspend을 60 개 mm 조직 배양 접시에 붓는다. 하지이 피펫을 시도, 폐암 덩어리 피펫의 내부에 충실합니다. </li><li> 쏟아지는 후 튜브를 씻어,뿐만 아니라 60mm의 조직 배양 접시에이 부어 추가 3 ML을 사용합니다. </li><li> 37 1 시간 동안 ° C 조직 문화 인큐베이터에 배치합니다. </li><li> 피펫 조직은 + 5 ML의 주사기에 15 G 무딘 바늘을 가진 콜라 슬러리 아래는 모든 큰 폐 조각이 중단 될 때까지. 조직 + 콜라 슬러리 보이지 조직 덩어리로이 시점에서 흐린 될 것입니다. </li><li> 새로운 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 넣고 자석에 연결합니다. </li><li> 조직의 모든 수집 된 것을 확실히하기 위하여 완전한 M199 매체의 약 5 ml의 조직 배양 접시를 씻어 원뿔 튜브에이 붓는다. </li><li> 콜라게나 + 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간은 거의 플로터가 될 것이며, 소형 철 함유 펠렛은 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에있을 것입니다. </li><li> 5 ML 완전한 의대로 세척배 아이오와. 이 콜라게나을 비활성화해야합니다. </li><li> 전체 미디어 3 ML을 추가하고, 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다. </li><li> 35mm 조직 문화 접시에 재 부유 펠렛을 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 그릇 조각이있을 것이다. </li><li> 하룻밤 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시 (플레이트 제로 표시) 놓습니다. 판 제로로 마이 그 레이션하는 최초의 세포는 평활근 마커 염색을 기준으로 약 50 %의 섬유 아세포와 50 % PASMC이다. 이 판은 도금 제로라는 궁극적으로 후속 농축 단계 후 파기됩니다. </li></ol> 2. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 둘째 날 <ol><li> 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 플레이트 0에서 상층 액 미디어를 붓는다. </li><li> 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간이 거의 플로터 수없고, 소형 철 콘타합니다ining 펠릿 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에 형성합니다. </li><li> 5 ML 완벽한 매체 배와 함께 씻으십시오. </li><li> 전체 미디어 3 ML을 추가하고, 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다. </li><li> 35mm 조직 배양 접시에 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 혈관 조각을 볼 수 있습니다. 이 (그림 1A) 플레이트 하나가 될 것입니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다. </li></ol> 3. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 여섯째 날 <ol><li> 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 접시 하나에서 상층 액 미디어를 붓는다. 이 단계를 여러 번 반복하면 혈관의 벽에 거주하는 평활근 세포의 모든 세포 배양 접시에 마이 그 레이션 할 수있는 기회를 가질 것을 보장한다. 각 플레이트 즉, 각 단계로 감소 반환 줄어들고 세포가 준수해야합니다 있습니다. </li><li다시 조직 문화 인큐베이터에 완전한 M199 미디어 및 장소&gt; Refeed 플레이트 하나. </li><li> 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간은 거의 플로터가 없을 것, 컴팩트 한 철 함유 펠렛은 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에 형성합니다. </li><li> 5 ML 완벽한 매체 배와 함께 씻으십시오. </li><li> 전체 미디어 3 ML을 추가하고, 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다. </li><li> 35mm 조직 배양 접시에 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 혈관 조각을 볼 수 있습니다. 이 플레이트 두 될 것입니다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다. </li></ol> 4. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 일 나인 <ol><li> 조직 배양 접시 플레이트 두에서 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 미디어 상층 액을 붓는다. </li><li> Refeed 완전한 M199 미디어 접시 두, 장소를 다시 조직 문화에인큐베이터. </li><li> 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간은 거의 플로터가 없을 것, 컴팩트 한 철 함유 펠렛은 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에 형성합니다. </li><li> 5 ML 완벽한 매체 배와 함께 씻으십시오. </li><li> 전체 미디어 3 ML을 추가하고 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다. </li><li> 35mm 조직 배양 접시에 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 혈관 조각을 볼 수 있습니다. 이 접시에 세 가지 일 것이다. </li><li> 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다. </li></ol> 5. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 일 살요 <ol><li> 1-3 판의 매체 오프를 대기음. </li><li> 부드럽게 따뜻한 멸균 PBS로 세포를 씻어. </li><li> 세포를 trypsinize 각 플레이트에 트립신 (~ 0.25-0.5 ML) 트립신의 얇은 필름을 추가합니다. 세포는 매우 부착하고 조직 cultu에 트립신에 있어야합니다판을 들어 올릴 정도 10 분 동안 인큐베이터를 다시. </li><li> 잔여 철 입자를 꺼내 자석에 부착 된 50 ML 원뿔 관에 5 ML 완벽한 매체로 번호판 떨어져 수확 세포. </li><li> 전체 미디어의 추가 0.5 ml의 플레이트의 각을 세척하고 50 ML 원뿔 튜브에 해당 미디어를 추가합니다. </li><li> 이 시간, 미디어 상층 액을 (대기음하지 않음) 걸릴, 그리고 철 입자의 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 판 60mm 접시에 5 ML 완전한 M199 미디어 세포는 몇 일에 합류 세포를받습니다. 또한, 플레이트 10 ㎖ 완전한 M199 10cm 플레이트 미디어, PASMC에있는 세포가 합류에 도달하는 약 다른 1-2주 소요됩니다. </li></ol> 6. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 일 포틴 <ol><li> 잔여 트립신을 제거하는 신선한 완전한 M199 미디어 매체를 변경합니다. 조직 배양 접시 (그림 1B)에 PASMC의 얇은 인구있을 것입니다. </li></ol> 7. 일반 관리 <ol><li> 신선한 완전한 M199 미디어 매체를 변경할 약 주 당 2 배. </li><li> 이러한 세포는 트립신의 영화 배양기에서 약 10 분은 (0.25-0.5 ML) 판을 들어 올릴 때는 셀 분할이 필요한 경우. 트립신 필름을 사용하면 셀의 회전을 멈추지 않고 PASMC의 replating 수 있습니다. 너무 많은 트립신을 사용하는 경우, PASMC는 트립신을 회전 원심 분리해야하며, 세포가 플레이트에 readhere하지 않습니다. 때로는 세포를 아래로 회전 한 후, 그것은 완전한 M199 미디어에 재현 탁 PASMC를 얻을 어렵습니다. </li><li> 관찰에 고립 PASMC 4-5 구절에 대한 신뢰성 평활근 세포처럼 행동하지만, 평활근 세포 통로 7까지 마커 고립 된 세포 얼룩 것입니다. 통로 2 (트립신에 처음 노출 된 후 도금)로 하루 열세의 첫 번째 풀 60mm 또는 10 센티미터 플레이트를 계산합니다. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+attenuates+pulmonary+inflammation+and+fibrin+deposition,+mortality+and+right+ventricular+hypertrophy+in+neonatal+hyperoxic+lung+injury.">Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury.</a> Respir. 10, 30 (2009).</li><li>Ladha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafil+improves+alveolar+growth+and+pulmonary+hypertension+in+hyperoxia-induced+lung+injury.">Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury.</a> Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+hyperoxia+increases+mitochondrial+oxidation+and+increases+phosphodiesterase+5+activity+in+fetal+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells.">Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106, 526-535 (2010).</li><li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Generated+at+Mitochondrial+Complex+III+Triggers+Acute+Responses+to+Hypoxia+in+the+Pulmonary+Circulation.">Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).</li><li>Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+artery+NADPH-oxidase+is+activated+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction.">Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).</li><li>Farrow, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+and+Inhaled+Nitric+Oxide+Normalize+Phosphodiesterase+5+Expression+and+Activity+in+Neonatal+Lambs+with+Persistent+Pulmonary+Hypertension.">Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 논문에서, 우리는 처음 P7, P14 및 P21에서 생쥐 PASMC의 분리에 대해 설명합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 아가와 0.2 μM 철 입자의 슬러리는 PA에 RV를 통해 주입된다. 철 입자의 작은 크기로 인해, 그들은 폐 모세 혈관을 통과 할 수 있으며, 따라서 작은 PA에 입금됩니다. 폐는 팽창 제거 해리된다. 철 함유 혈관 자석을 사용하여 솔루션을 떠나게된다. 궁극적으로, 혈관 조직 배양 접시에 도금하...

태반 가스 교환의 주요 기관의 역할과 심 박출량의 10 %가 폐 혈관 침대를 통해 순환하기 때문에 폐동맥 고혈압은 자궁 수명 기간 동안 정상입니다. 자궁, 폐 압력이 높은 폐 혈관 저항에 의한 전신 압력과 유사하다 . 임신이 진행되면서, 폐 내의 작은 PA의 급속한 성장은 출생 1에서 발생 폐 혈류의 극적인 증가를위한 태아 준비가있다. 일반 산기 전환이 가까운 기간 및 전체 기간 유아에 실패하면, 결과는 (PPHN) 신생아의 지속성 폐동맥 고혈압이다. PPHN는 다양한 기본 병리에 의한 임상 증후군이다. 그러나 이러한 유아의는 동맥관로 또는 영구적 태아의 연결을 통해 이러한 높은 폐 혈관 저항, 저산소증,과 혈액 흐름의 오른쪽에서 왼쪽으로 션트과 같은 일반적인 병태 생리 학적 기능을 공유의 ovale 아멘. PPHN은 1,000 명당 2-6에 영향을 미치는 사망률뿐만 아니라 상당한 단기 및 장기 사망률 2의 8-10 %의 위험을 전달합니다. 또한, 매우 낮은 출생 체중 미숙아는 기본 폐 질환의 결과로 폐동맥 고혈압을 개발할 수 있습니다. 미숙아의 가장 일반적인 기본 폐 질환은 기관지 이형성증 (BPD)입니다. BPD의 전반적인 위험은 재태 연령과 출생 체중과 관련이 있지만 이러한 유아의 집합 상당한 폐 고혈압과 방법을 적절하게 이러한 유아 치료 방법을 개발 이유는 확실하지 않다. 장기간의 입원 및 사망률 증가 등의 나쁜 결과는 3-6 일반적입니다. 역사적으로, 건강한 동물로부터 양의 태아 PASMC 또는 돼지 태아 PASMC는 출생 후 정상적인 폐 혈관 변화에 관련된 신호 전달 경로를 연구하는 데 사용되었습니다. 이들은 일반적으로 다섯 번째 세대 저항 PA에서 격리됩니다N 양의하거나 자발적 호흡 7-9 이전에 전달하고 안락사되는 돼지 태아. 또한, 일부 연구자들은 고립 된 약간 이상에서 PASMC 활용하고 자발적으로 1 일, 1 주, 4 주 10-12에서 양 및 돼지를 호흡했다. 최근에는 일부 그룹이 성공적으로 고립 질병 상태 13-17에서 경로 신호에 derangements를 검사 PPHN과 양에서 분리 PASMC을 활용했다. 이러한 세포는 신호 경로가 정상과 질병 단기 및 장기 폐 혈관 모두에서 중요하다 어떤 검사하는 유용한 도구가 될 입증했다. 그러나, 그들은 폐 고혈압 미숙아에 영향 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 또한 그들은 질병의 마우스 모델에서 본 유전자 조작의 가능성을 허용합니다. 쥐와 마우스 모델은 긴 모델 BPD에 사용되었습니다 그리고 더 최근의 모델 폐 HY에 사용되는BPD 18-22 인한 pertension. 신생아 쥐들은 더 큰 크기로 인해 작업을 유혹하는 있지만, 그들은 또한 유전자 변형에 대한 가능성의 부족으로 고통 받고 있습니다. 유전자 변형 동물은 광범위 신생아 생쥐에서 전체 동물 생리학의 특정 유전자 표적의 효과를 조사하기 위해,하지만 아무도 이전에 성공적으로이 작은 생쥐 PASMC 고립 없다 최신 사용되었습니다. PASMC을 분리하여, 더 많은 정보는 경로가 환경 자극 및 / 또는 폐동맥 평활근 구체적으로 유전자 조작에 대한 응답으로 변경하는 방법에 대해 얻을 수 있습니다. 또한, 라이브 PASMC는 칼슘과 반응 산소 종 23-25와 같은 핵심 신호 분자의 급속한 변화를 검사하는 실시간 군데 할 수 있습니다. 우리는 최근 마샬 등의 기술 변화를 사용하여 성인 마우스에서 PASMC의 성공적인 격리를 설명했다. 26 쥐에게 PASMC 23,25,26를 분리하는 데 사용됩니다. 우리는 지금을 적응ND는 7-21일 시대의 작은 쥐 (P7, P14 및 P21)에이 기술을 확장했다. 이 새로운 PASMC 분리 기술에 대한 기본 한계는 실험을위한 충분한 세포를 생성하기 위해 여러 쥐를 필요로하며, 세포가 기본 평활근 세포의 특징 인, 아주 천천히 성장하는 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리는 신생아 마우스 PASMC을 분리하는이 기술은 폐동맥 고혈압의 개발에 관여하고이 분야에서 상당한 진보를 대표하는 중요한 신호 전달 경로의 향상된 조사 할 것으로 판단된다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

폐동맥 고혈압은 사망률과 유아 사망률의 중요한 원인이다. 역사적으로, 태아 양에서 PASMC 혈관 평활근 수축에 관여 신호 경로의 중요한 연구가 있었다. 양 기간 폐동맥 고혈압의 훌륭한 모델을 만드는 동안, 그들은 매우 고가이며 생쥐에서 발견 된 유전자 조작의 장점을 부족합니다. 반대로, 마우스에서 PASMC를 분리 할 수​​ 없다는 그 시스템의 중요한 제한했다. 여기에서 우리는 마샬 등의 이전에 설명한 기법의 변형을 사용하여 P7, P14 및 P21 마우스에서 마우스 PASMC의 차 문화의 격리를 설명했다. 26 일 이전에 쥐 PASMC을 분리하는 데 사용합니다. 이 생쥐 PASMC은 신생아시기에 경로 신호의 연구를위한 새로운 도구를 나타냅니다. 간단히, 0.5 %의 슬러리 (W / V) 아가 + M199 미디어에서 0.5 % 철 입자가 우심실 (RV)을 통해 폐 혈관 침대로 주입된다.철 입자의 직경은 0.2 μM이며, 폐 모세 혈관을 통과 할 수 없습니다. 따라서, 작은 폐동맥 (PA)에있는 철 라지. 폐를 제거하고 해리 아가로 팽창하고 있습니다. 철 함유 혈관 자석으로 내려 오게된다. 콜라게나 제 (80 U / ㎖) 처리 및 추가로 분리 한 후, 혈관 배양 접시에 세포 이동을 허용하는 20 % 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제 (M199 완전한 미디어)를 포​​함 M199 미디어 조직 배양 접시에 넣고 . 세포의이 초기 판은 섬유 아세포와 PASMC의 비율로 혼합입니다. 따라서, 절차 풀다운는보다 순수 PASMC 인구를 달성하고 잔여 철분을 제거하기 위해 여러 번 반복됩니다. 평활근 세포의 ID는 평활근 마이 오신과 최근 desmin에 대한 면역 염색에 의해 확인된다.

격리하는 동안 후, PASMC는 광학 현미경으로 부드러운 근육 세포 마커에 대한 면역 염색으로 모두 검사합니다. 초기 프로토콜 광학 현미경으로 PASMC은 혈관 (그림 1A)를 포함하는 작은 철의 조직 배양 접시에 마이그레이션 볼 수 있습니다. 하루 열세에 플레이트 세를 통해 하나를 풀링 한 후, 다음 철 입자는 그이 최종 풀링 단계에서 떼어 낸 것처럼 더 이상 볼되지 않습니다. 대신, PASMC의...

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Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

우리는 따라서 신생아 평활근 세포의 수축과 이완에 관련된 신호 전달 경로의 더 나은 연구를 허용, 소설과 P7 등의 어린 쥐에서 폐 혈관 평활근 세포의 일차 배양 (PASMC)를 분리하는 재생 기술을 개발했습니다.

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

isolation-of-pulmonary-artery-smooth-muscle-cells-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K 조회수.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. 우리는 따라서 신생아 평활근 세포의 수축과 이완에 관련된 신호 전달 경로의 더 나은 연구를 허용, 소설과 P7 등의 어린 쥐에서 폐 혈관 평활근 세포의 일차 배양 (PASMC)를 분리하는 재생 기술을 개발했습니다.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

연구

생물학

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

클릭 화학을 사용하여 혈관 평활근 세포의 증식 측정

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...