표면 결합 프로브를 사용하는 단일 분자 FRET 실험은 과거에 고정 된 분자에 거의 독점적으로 수행되었습니다. 그러나, 많은 생체 분자 확산 하 고 우리의 방법으로 분석될 수 있다. 단일 분자 FRET와 추적을 결합하면 움직이는 프로브의 FRET 결핍 시간 추적뿐만 아니라 확산 행동과 같은 현면 측면을 조사할 수 있습니다.
우리의 방법은 다양한 FRET 기반 프로브와 호환됩니다. 예를 들면, 그것은 살아있는 세포 실험에 있는 분자 힘, 형성 역학 및 결합 역학에 관하여 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 고품질 단일 분자 FRET 실험은 수행하기가 매우 어렵습니다.
신뢰할 수 있는 정량화를 위해 충분한 길이의 좋은 신호 대 잡음 비율 및 단일 분자 트랙으로 데이터를 기록하는 것이 중요합니다. 샘플 측정을 시작하려면 카메라를 트리거하는 동안 기증자와 수락자 형광을 적절한 조명 시간에 흥분시키고 카메라 판독이 활성화 될 때까지 기다립니다. 기증자와 수락자 형광의 흥분을 반복합니다.
단계별 광표백 분석을 허용하는 시야 내에서 프로브 당 적어도 하나의 플루오로포어의 광표백을 보장하기에 충분한 큰 반복 횟수를 선택하여 골재로부터 단일 분자 신호를 차별한다. 기록된 이미지 시퀀스에서 이미지 세분화를 위한 프레임뿐만 아니라 기증자 및 수락자 여기 프레임을 선택할 수 있도록 조명 시퀀스를 지정합니다. 동시에 동일한 조명 설정을 사용하여 기록된 데이터 집합을 분석합니다.
이를 위해 각 데이터 집합에 각각의 이미지 시퀀스 파일 이름과 일치하는 식별자 및 패턴을 할당합니다. 또한 이미지 등록을 위한 신탁 마커 녹음, 플랫 필드 보정을 위한 등계 광 프로파일, 선택적 기증자 전용 및 수락자 전용 샘플 과 같은 특수 목적을 위해 특정 데이터 집합을 정의하여 보정 요소를 결정합니다. 다음으로, 두 채널이 단일 카메라를 사용하여 기록되는 경우 배출 채널과 원시 이미지를 선택합니다.
이를 위해 적절한 그래픽 위젯을 사용하여 기증자 및 수락자 배출에 적합한 영역을 선택한 다음 배출 채널 모두에서 수탁마커를 국소화하고 이미지 등록을 수행합니다. 제공된 사용자 인터페이스를 사용하여 기증자 및 수락자 배출 채널 모두에 대한 지역화 알고리즘에 적합한 매개 변수를 찾습니다. 다음으로, 기증자 및 수용자 방출로부터 얻은 이미지의 합계로 기증자 여기시 FRET 프로브에 대한 단일 분자 지역화 매개변수를 설정한 다음, 수용자 방출 채널에서 수용자 여기시 프로브에 대한 국소화 매개 변수를 설정합니다.
모든 프레임에서 기부자 및 수락자 여기를 독립적으로 사용할 때 FRET 프로브를 현지화합니다. 결과는 원본 프레임 번호, 2차원 좌표 및 원본 이미지 파일을 참조하는 식별자를 포함하는 하나의 테이블로 병합됩니다. 형광 강도를 추적하고 측정하려면 Trackpy 알고리즘에 적합한 옵션을 선택하여 FRET 프로브 지역화를 궤적에 연결합니다.
다음으로 분석 소프트웨어 기능을 사용하여 이미지 시퀀스에서 보조 이미지 데이터를 처리합니다. 여기 시퀀스에서 S로 표시된 세분화를 용이하게 하기 위해 기록된 추가 이미지를 추출합니다. 마지막으로, 조밀하게 표지된 샘플에 기록된 이미지에서 시야전반에 걸쳐 기증자 및 수락자 흥분 광 프로파일을 결정합니다.
초기 필터링 단계의 경우 형광 강도를 안정적으로 결정하기 어렵기 때문에 겹치는 점 확산 기능을 사용하여 신호를 폐기하십시오. 불균성 조명의 경우, 좋은 신호 대 잡음 비율을 보장하기 위해 시야 내의 조명 이면에 있는 신호만 허용한다. 분자 내 FRET를 공부하는 경우, 이미지 시퀀스의 시작부분에서 존재하는 궤적으로 분석을 제한한다.
다음으로, 앞서 획득한 광원 프로파일을 사용하여 불균성 조명으로 인한 위치 의존형 형광 강도 변동을 되돌리고 명백한 FRET 효율과 명백한 stoichiometry를 계산하는 평평한 필드 보정을 실행한다. 단일 분자 프로브와 골재 간의 차별에 대한 광표백의 단계별 분석을 수행하려면 기증자 및 수락자 여기에 따라 변경 점 검출 알고리즘에 적합한 매개 변수를 별도로 찾아보십시오. 그런 다음 변경 점 감지 알고리즘을 실행합니다.
모호한 광표백 동작을 보여주는 트랙을 제거하려면 형광이 표백된 것으로 간주되는 강도 임계값을 정의한 다음 다음 옵션 중 하나를 선택합니다. 옵션 하나는 기증자가 부분 표백을 보여주지 않는 동안 한 단계로 수용자 형광표백을 하는 것을 여기서 선별한다. 옵션 2는 기증자가 부분 적인 수용체 표백이 없는 동안 한 단계로 표백하는 것을 허용합니다.
옵션 3은 한 단계로 형광표백제중 하나를 표백하는 반면 다른 하나는 부분적으로 표백하지 않는다. 그리고 옵션 4 에 기증자 및 수용자 형광은 단단계 광표백 또는 전혀 표백을 표시하지 않습니다. 그런 다음 기부자 배출 누출에 대한 보정 요인을 수락 채널, 직접 수락자 여기, 검출 효율성 및 흥분 효율성으로 계산합니다.
다음으로 보정 요소를 사용하여 명백한 효율성과 명백한 stoichiometry의 stoichiometry에서 FRET 효율을 계산합니다. 추가 필터링을 위해 각 궤도에서 첫 번째 표백 이벤트 이전의 데이터 점만 선택합니다. 또한 분석을 단일 분자 프로브로 제한하려면 적절한 스토이치오메트리 한계 내에서 데이터 포인트의 75% 이상을 가진 궤적만 허용합니다.
그런 다음 적절한 보조 이미지에서 전역 또는 적응형 임계값 을 통해 이미지 세분화를 수행하여 분석을 시야 내의 다른 영역으로 제한합니다. 잘못된 스토이치오메트리의 신호가 올바르게 식별되고 제거되었는지 확인하기 위해 효율성 과 스토이치오메트리 플롯을 만듭니다. 그런 다음 FRET 효율성의 히스토그램을 플롯하여 FRET 효율성 분포에 대한 잘 확립된 개요를 제공하고 히스토그램을 그룹화하여 다양한 실험에서 결과를 편리하게 비교합니다.
과학 파이썬 라이브러리를 활용하여 전자 필기장 내의 데이터를 추가로 평가하여 확산 분석과 같은 성능을 발휘할 수 있습니다. 단일 분자 FRET 이벤트의 시각화 및 추적은 여기에 표시됩니다. 필터링된 FRET 이벤트는 FRET 효율 히스토그램의 효율성 대 스토이치오메트리 플롯으로 표현됩니다.
또한, 이동성 매개 변수는 XY 플롯 또는 평균 제곱 변위 플롯에서 개별 궤도 경로를 플로팅하여 조사할 수 있다. 플랫폼의 출력을 통해 모바일 프로브의 FRET 효율 시간 추적에서 전환을 더욱 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 생체 분자의 형성 적 변화를 평가한다.
FRET 기반 힘 센서를 사용하여 분석 플랫폼을 사용하면 초기 T 세포 신호 시그널링 중에 면역 학적 시냅스 내에서 단일 분자 힘 이벤트를 정량화 할 수있었습니다.
