안구 표면 염증의 유도 및 관련 조직의 수집

이 프로토콜은 안구 표면 염증의 유도와 관련된 단계와 Meibomian 샘 기능 장애와 관련된 관련 영향을받는 기관의 수집을 순차적으로 설명합니다. 이 새로운 MGD 모델은 질병의 선천성 면역 측면, 특히 마이보미아선을 막는 호중구 세포외 트랩의 형성을 조사할 수 있습니다. 프로토콜에 전시된 기술은 전임상 단계에서 국소 치료적 개입을 도입하도록 확장될 수 있다.

또한, 안구 삼출물과 장기의 수집은 치료의 효능을 반영합니다. 면역원 용액의 복강내 주사를 수행하기 위해, 7 내지 9주령의 C57 검정 6마리 마취되지 않은 암컷 마우스를 케이지 격자를 잡으면서 꼬리로 부드럽게 잡는다. 그런 다음 엄지와 검지 사이의 등 및 목 부위의 피부를 단단히 잡고 약지와 새끼 손가락 사이의 꼬리와하지를 손바닥에 고정하십시오.

마우스를 머리가 아래로 향하도록 고정시킨 상태에서 준비된 면역 원 용액 100 마이크로 리터를 하복부의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면에 주입하십시오. 예방 접종 후 안구 표면 챌린지를 수행하려면 마취 된 마우스의 눈 당 5 마이크로 리터의 오발 알부민 또는 난자 또는 식염수를 적용하고 방울이 눈에 흡수 될 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 다음으로, 챌린지 직후 50 마이크로 리터의 멸균 식염수를 눈에 적용하여 안구 삼출물을 수집하십시오.

안구 표면 조직을 절제하려면 마우스를 평평한 표면에 놓고 70 % 에탄올 면봉으로 눈 주위의 안와 부위를 소독하십시오. 눈 주위에 절개를 형성하려면 귀와 후 안와 동 사이와 편평 뼈 위의 표면을 따라 수직으로 절개하여 상악골을 따라 아래 눈꺼풀 아래로, 정면 뼈를 따라 위 눈꺼풀 위로 절개를 확장합니다. 구부러진 집게를 사용하여 눈 주위의 해부 된 조직을 조심스럽게 잡고 조직과 안구를 빼냅니다.

절제된 장기를 멸균 PBS에 넣습니다. 그런 다음 실체 현미경으로 메스를 사용하여 절제된 위 눈꺼풀 주변의 과도한 안면 근육 조직을 다듬습니다. 결막을 수집하려면 위 눈꺼풀을 마른 페트리 접시에 놓습니다.

그런 다음 미세한 핀셋과 메스를 사용하여 눈꺼풀 안쪽 표면에서 희끄무레 한 점액층을 부드럽게 벗겨냅니다. 각막을 해부하려면 드라이 아이스 위에 새로운 마른 페트리 접시에 아이 글로브를 놓습니다. 3 분 후 접시를 벤치 표면에 안정된 위치에 놓습니다.

가늘고 날카로운 가위를 사용하여 윤부 옆의 각막 경계에 작은 절개를하십시오. 눈 지구 주위에 메스로 절개를 계속하여 각막에서 공막을 분리하십시오. 그런 다음 식염수로 넉넉하게 씻어내어 각막 뒷면에서 홍채와 렌즈 잔여물을 제거합니다.

마이보미아샘과 그 구멍을 평가하려면 절제된 눈꺼풀을 실체 현미경 아래 똑바로 세웁니다. 그런 다음 카메라 노출 시간 및 ISO 설정에 따라 백색광 에피 조명 아래에서 이미지를 캡처합니다. Meibomian 샘 영역을 평가하려면 절제 된 눈꺼풀을 수평 위치에 놓고 적외선 카메라가 장착 된 실체 현미경의 백라이트를 켭니다.

카메라 ISO에 따라 노출 시간을 조정하여 이미지를 캡처합니다. 식염수를 투여한 마우스는 눈을 크게 뜨고 건강한 안구 표면을 보였다. 이에 비해 난자 적용은 심한 안구 표면 염증, 눈의 좁은 열림 및 화학 요법의 징후를 유발합니다.

절제된 눈꺼풀은 눈꺼풀을 감싸는 샘의 작은 플러그를 보여주는 건강한 눈꺼풀과 대조적으로 마이보미안 샘의 구멍과 부종을 막는 큰 폐색을 보여주었습니다. 샘의 적외선 투과 조명에 대한 추가 검사는 Meibomian 샘의 acini의 라세미 모양을 보여줍니다. 식염수에 도전한 마우스의 눈꺼풀은 둥근 아시니를 보여주었다.

이에 비해 난자 적용은 알레르기성 안 질환 또는 AED가 있는 일부 땀샘의 파괴 및 손실을 유도했습니다. 눈꺼풀의 조직학적 분석은 식염수만 투여한 마우스에 비해 확장된 마이보미안 땀샘을 나타냈습니다. 드라이 아이스에서 안구를 배양하면 윤부 옆의 각막을 절개하고 각막에서 각막을 분리 할 수있었습니다.

이 연구는 각막 수집을 촉진했습니다. 또한, 난자 투여는 결막에 심한 염증을 일으켜 충혈 증상을 보였다. 케모카인 CXCL-1의 상승된 수준은 호중구 혈관외 유출, 식균작용 및 탈과립을 촉진하고, 급성기 반응 및 호중구 침윤을 매개하는 인터루킨-6이 AED 마우스의 상청액에서 관찰되었다.

반면에, 인터루킨-10의 농도는 나이브 마우스와 AED 마우스 모두에서 유의한 변화를 나타내지 않았다. 이 새로운 모델은 선천성 면역 경로를 표적으로 하는 약물의 효능을 개발하고 평가할 수 있게 하며, 항염증제 투여 방식의 데이터 마이닝에 큰 도움이 됩니다. 적절한 장기 수집 후 단일 세포 시퀀싱 및 이미징 질량 세포 분석과 같은 고도의 다중 방법이 이 프로토콜과 호환됩니다.