저자는 기술 단계를 돕는 Nandini Nallappan 및 Sharon Yeo에게 감사드립니다. 이 연구는 이공천 (Lee Kong Chian) 의대, 남양 공대 (Nanyang Technological University)의 KGC 창업 보조금 및 싱가포르 보건 성 국립 의료 연구위원회 (National Medical Research Council, NMRC)의 고위 임상 의학자 상 (Northern Clinician Scientist Award)의 LT (NMRC / CSA / 045 / 2012), NMRC의 보조금으로 KGC와 LT (NHIC-12D-1409007)에 국가 보건 혁신 센터 (National Health Innovation Center)가 관리한다.

이 연구에 사용 된 모든 안구 샘플은 SingHealth Centralized Institutional Review Board와 싱가포르 남양 기술 대학교 제도 심사위원회의 승인을받은 싱가포르 국립 안과 센터의 Dry Eye Clinic에서 수집했습니다. 참고 : 피험자는 IC를 실시하기 전에 염증 정도와 눈물 기능 장애의 중증도를 평가하기 위해 임상 검사를 받았다. 임상 시험은 진단 장비, Schirmer &#39;s test 17 , SPEED (Standard Patient Evaluation of Eye Dryness) 18 설문지, 각막 절개술 (SPEED) 설문 18을 사용하여 비 침습적 눈물 방울 차단 시간 (NI-TBUT) 14 및 결막 충혈 염색 19 . 1. IC에 의한 안구 샘플 채취 <ol><li> 임상 상태의 결정 후, 마취참가자의 눈은 상지 구 및 결막에 1 ~ 2 방울의 국소 마취제 인 염산 프로 팔라 카인 (proparacaine hydrochloride)을 적용하여 관찰 하였다. 마취의 쑤시는 감각이 지치기까지 4 ~ 5 분 동안 기다리십시오. </li><li> 두 가지 인상 세포학 장치로 비강 결막 결막에서 샘플을 수집합니다. 참고 : 두 개의 노출 샘플을 수집하는 데 하나의 장치가 사용됩니다. 여기서는 두 개의 장치를 사용하여 4 개의 임프레션 멤브레인을 수집했습니다. <ol><li> 결막에 인상 세포학 장치를 접선 방향으로 위치시킵니다. 누름 단추를 부드럽게 누르고 2 - 3 초 동안 누릅니다. 참고 : 장치는 멤브레인과 함께 제공됩니다. 버튼을 누르면 압력이 자동으로 해제됩니다. 압력을 해제하고 장치를 제거하는 데 단지 몇 초가 걸립니다. </li></ol></li><li> 막 1 ML 문화 미디어 (로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) + 10 % 태아 소 혈청이 들어있는 microcentrifuge 튜브로 막을 출시(FBS) + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 스트렙토 마이신) </li><li> 10 μL 피펫 팁으로 약 1 분 동안 지속적으로 긁어 냄으로써 장치의 막에서 세포를 분리합니다. 참고 : 멤브레인 표면이 고르지 않으면 긁힘이 완료됩니다. 각 막으로부터의 세포 수는 가변적이다 (100 - 500 세포 / 막). 수집 2 ~ 3 시간 이내에 샘플을 처리하십시오. </li></ol> 2. 유동 세포 계측법에 의한 세포의 면역 표현형 측정 <ol><li> 매체를 제거 실온에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 유동 세포 계측법 완충액 (인산 완충 식염수 (PBS) + 0.05 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 50 μL로 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 항체 ( 예 : CD3 브릴리언트 바이올렛 (BV) 510 (UCHT1), CD4 알로 피코시 아닌 -H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 피코 에리 트린 (PE) -A, CD45RO PE 시아닌 7 Cy7) -A, live / dead cell mark 7-ADD)를 실온에서 20-30 분 동안어두운. 제조업체의 프로토콜에 따라 항체를 직접 사용하십시오. 참고 : 항체 농도는 CD3-BV510 2.5 μL, CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD 1.25 μL 및 CCR7-PE 10 μL를 사용하십시오. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 사용하여 다양한 농도의 항체를 적정합니다. 적정을 위해 제조자의 프로토콜에 언급 된 항체 농도를 취하고 권장 농도의 1/2을 사용하십시오. 다른 형광 색 채널로 넘치지 않도록 항체의 최소 농도를 사용하십시오. 언급 된 항체 농도에서 명확한 신호가 관찰되었습니다. 보정은 초기에 Williams et al .에서 언급 된 프로토콜에 따라 PBMC를 시험함으로써 수행되었다. 시험을 위해 PBMC를 여기에 사용 된 동일한 항체 세트와 함께 배양하고 단일 및 다중 항체 얼룩을 비교하여 보상했습니다. </li><li> 부화 후od, 튜브에 얼룩 버퍼 1 ML을 추가 잘 혼합하고 실온에서 5 분 450 XG에서 원심 분리기. 얼룩 버퍼 200 μL에 Resuspend 세포. </li><li> 플로우 cytometry 기계에서 샘플을 실행합니다. <ol><li> 데이터를 수집하기 전에 제조 업체의 지침에 따라 다른 일에 데이터 수집을 정상화하기 위해 cytometer 설정 및 추적 (CS &amp; T) 비즈와 함께 흐름 cytometer의 채널 전압을 보정. <ol><li> 유동 세포 계측법 데이터 수집 소프트웨어를 열고 &quot;Set up &amp; QC&quot;버튼을 클릭하고 올바른 CS &amp; T 비드 로트 번호를 선택하고 비즈를로드 한 다음 &quot;시작&quot;버튼을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 기계에 샘플을로드하기 전에 부드럽게 튜브를 두드려 세포를 Resuspend. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 &quot;미리보기&quot;를 클릭하십시오. 임계 값 속도가 안정되면 &quot;획득&quot;을 클릭하십시오. 샘플 레벨을 모니터하고 샘플이 부족하면 &quot;중지&quot;를 클릭하십시오. 참고 : 샘플 당 10,000 개의 이벤트를 확보하십시오. </li&gt; <li> 10,000 이벤트를 획득 한 후, 워크 시트에 SSC-A 및 FSC-A 도트 플롯을 생성하십시오. <ol><li> &quot;Polygon Gate&quot;버튼을 클릭하고 파편을 제외하기 위해 FSC-A 값&gt; 5 x 10 4 인 모든 이벤트에 게이트 (P1 임)를 그립니다. &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 연 다음 &quot;P1&quot;을 선택하십시오. P1 도트 플롯의 X 축에서 FSC-A를 클릭하고 CD3-BV510으로 변경하십시오. &#39;다각형 게이트&#39;를 그려 CD3 + 인구를 선택하고 이름을 &#39;P2&#39;로 지정하십시오. </li><li> &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 엽니 다. P2 도트 플롯의 x 축에있는 FSC-A를 클릭하고 7-AAD로 변경하십시오. 7-AAD 인구를위한 &#39;다각형 게이트&#39;를 그리고 &#39;P3&#39;을 선택하십시오. 여기서 P3은 CD3 +살아있는 세포. </li><li> &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 엽니 다. X 축에서 CD3-BV510을 클릭하고 P3 도트 플롯의 y 축에서 CD4-APCH7을 클릭합니다. 직사각형 그리기 사분면의 위쪽과 아래쪽에 각각 &#39;P4&#39;와 &#39;P5&#39;를 선택하십시오. P4는 라이브 CD3 + CD4 + 이고 P5는 라이브 CD3 + CD4 - T 세포입니다. </li><li> &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 엽니 다. X 축에서 CD45RO PE-Cy7을 클릭하고 P4 및 P5 플롯의 y 축에서 CCR7-PE를 클릭합니다. 이 점 그림에 &#39;쿼드 게이트&#39;를 그립니다. 참고 : 여기 왼쪽 위, 오른쪽 위, 오른쪽 아래 및 오른쪽 아래 사분면은 순진한 중앙 메모리 (T CM ), 전자(T EM ), 최종 분화 된 이펙터 메모리 (T EMRA ) T 세포를 포함한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta++T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4++T+cells+increases.">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li><li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis.">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li></ol>

저자는 경쟁적인 금융 이익을 선언하지 않습니다.

이는 스크래핑, 스왑 핑, 피펫 팅 또는 흡착 여과지 1 , 2 와 같은 기존 기술과 비교하여 비교적 빠른 면역 프로파일 링을 위해 외래 진료소에서 사용할 수있는 쉽고 빠르며 덜 침습적 인 기술입니다. 이 기법의 변형은 연구 설정에서 이미 사용되고 있습니다 22 . 향후 제안 된 방법론의 적용은 안구 질환, 특히 면역 표현형을 필요로하는 임상 시험에서 환자 층화에 적용됩니다. 이 기술의 주요 문제점은 인상 채취 및 스크래핑 후에 회수되는 비교적 적은 면역 세포입니다. 개체 당 4 번의 노출에서 회복 된 CD3 + T 세포의 총 수는 ~ 500 ~ 1,000 개의 세포에서 다양합니다. 안구 샘플은 세포의 추가 손실을 피하기 위해 최소 횟수 동안 유세포 분석을하기 전에 세척 하였다에스. 프로토콜 내에 남아있는 중요한 단계와 과제는 높은 세포 수를 달성하기 위해 눈 샘플을 효율적으로 수집하고 멤브레인을 적절히 스크래핑하는 것입니다. 그럼에도 불구하고이 제한은 특정 면역 표현형에 편향되지는 않을 것입니다. 세포 수율을 극대화하기 위해 여기에서 수행 된 문제 해결은 항체 배양 후 및 배양 전 세척 단계 수를 줄이는 것이 었습니다. IC 사용에는 다른 제한 사항이 있습니다. 스티븐 존슨 (Steven Johnson) 증후군과 같이 심하게 각화되거나 섬유화 된 안구 표면을 가진 환자에서 세포 수율은 본 연구에서보다 낮을 수 있습니다. 같은 날 분석하지 않고 샘플을 보관하면 면역 세포의 비율이 달라질 수 있습니다. 특정 세포 유형이 다른 세포 유형보다 저장에 내성이 있는지를 예측하는 것은 어렵습니다. 이전 연구에서 결막 상피 세포의 HLA-DR 발현이 증가한 것으로보고되었으므로HLA-DR과 특정 면역 세포의 수준 사이의 상관 관계를 평가하기 위해 esting. 면역 세포는 또한 케모카인의 발현 수준과 관련 될 수있다. 이러한 문제는 향후 연구에서 다루어 져야한다.

Impression cytology (IC)는 Thatcher et al .에 의해 1977 년에 처음 수행되었다 . 그들은 스크래핑, 스왑 또는 피펫 팅과 같은 그 당시 사용 가능한 다른 기술 대신 환자로부터 결막 세포를 수집하기 위해 플라스틱 인상 디스크를 사용했습니다 1 . IC의 현재 기술은 구와 눈의 결막을 각인시키고 결막 세포의 가장 표면층을 모으기 위해 흡수성 여과지 2 를 사용합니다. 분화의 최종 단계에 도달 한이 세포들은 계속 눈물을 흘립니다 3 . 상피 세포 4 , 상 세포 3 , 5 및 점막 관련 림프 조직 - 상피 - 관련 이펙터 T 세포 또는 수지상 세포 6의 세 가지 주요 개체군이 IC 표본에서 발견됩니다. IC 칩 표면의 안구 세포ples은 현미경 검사, 면역 블 랏팅 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 분석 할 수 있습니다 7 . 유동 세포 계측법은 최근에 IC 멤브레인을 긁어서 수집 한 면역 세포를 분석하는데 사용되었습니다 8 . 흥미롭게도 IC6,9는 점막 각 결막염, 비타민 A 결핍, 간질 성 천포창, 아토피 성 질환, 상연 성 각 결막염, 춘추 각 결막염 및 상피 편평 상피화를 포함한 많은 안구 질환을 평가하는데 사용되어왔다. IC는 또한 콘택트 렌즈 착용, 안구 표면 미생물 검출, 종단 연구 10 , 11 , 12의 치료 효과 및 내성 시험에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었습니다. 의료 기기 (EyePrim)는 일종의 폴리이전에 유동 세포 계측법 (OSIC-flow)으로 안과 인상 세포학 기술에 대해 검증 된 종전 샘플링을 사용하여 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 모니터 할 수있는 기회를 열어주는 PES 0.2 μm 멤브레인 점막 유 천포창에서 진행성 결막 섬유증의 추정 질환 마커로 정의 된 상피 세포 백혈구 분석 13) . 초기 연구자들은 수동 인상이 필요한 고압 증기 멸균 된 PES 필터를 사용했습니다. 결과적으로 생산량은 가변적이었고 사용자에 따라 결정되었습니다. 이 의료 기기의 장점은 사용 편의성, 표준화 된 압력 (Pa 또는 N / m 2 )이며 반복성, 재현성 및 일관된 세포 재생을 가능하게합니다. 이 기술은 비 외과 수술이며, 수행하기 쉽고 빠르기 때문에 외래 환자 클리닉에서 유용합니다. 이 지침은 지침 93 / 42 / CEE, CE 0499 (SNCH)에 따라 Class I (무균) 의료 장비입니다. 필요한 것만이는 안구 표면의 무결성 유지를 보장하는 시술 중의 국소 마취이다. IC 이후에, 세포는 유동 세포 계측법을 위해 즉시 처리 될 수 있습니다. 또한, 비 안과 기술자 및 간호사가 안구 표면을 샘플링하도록 훈련받을 수 있습니다. 다른 기술에 비해 IC의 향상에도 불구하고 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, IC의 위치에 따라 샘플링 영역 및 구 결막에서 지역적 차이로 인해 변동이있을 수 있습니다. 변동의 또 다른 원인은 IC 동안 다양한 양의 압력을 가하기 때문입니다. 다른 방법 론적 쟁점은 세포 처리 표준화와 관련이있다. 여기에는 지속 기간과 고정 방법, 시료 채취 된 물질의 안정성에 영향을 줄 수있는 저장 조건이 포함된다. 이 기술의 전반적인 목표는 안구 인상 샘플을 고립시키는 방법을 개발하는 것입니다.t는 사용하기 쉽고 비 침습적이며 임상 샘플의 면역 학적 특성 분석에 적용 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD3 BV510</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">563109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD4 APCH7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">641398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD45RO PECy7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">337168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">7-AAD solution</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">555816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CCR7 PE</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">552176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Pippetes</td>
			<td style="width:300px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Local Anaesthesia</td>
			<td style="width:300px;">Alcaine</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Equipments</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Keratograph 5M</td>
			<td>Oculus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Slit lamp BioMicroscope</td>
			<td>Haag Streit</td>
			<td>BM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">EyePrim</td>
			<td>Opia Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACS Verse</td>
			<td style="width:300px;">BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Softwares</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">GraphPad 6.0</td>
			<td style="width:300px;">Prism</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACSVerse analysis software</td>
			<td style="width:300px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

전통적으로 안구 표면 세포학은 주걱 기술 및 브러시 기술과 같은 기술로 연구됩니다. 이 기술의 문제점은 눈의 표면에 외상성 병변을 유발할 수 있다는 것입니다. 외상성 병변은 흉터, 눈꺼풀의 기형, 윤부 줄기 세포 결핍으로 진행될 수 있으며 경우에 따라 피험자에게 커다란 불편 함을 유발할 수 있습니다. 이러한 임상 적 문제를 피하기 위해 안구 건조증과 신 생물, 아토피 성 질환, 춘추 각 결막염 및 각 결막염을 진단하기위한 인상 세포학 (IC)이 개발되었습니다. 전형적으로, 임상의는 수작업으로 여과지를 필요한 모양으로 자르고이를 안구 표면에 적용합니다. 여기서는 시중에서 판매되는 의료 기기를 사용하여 IC를 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기법은 유동 세포 계측법에 의한 면역 표현형 분석이 뒤 따릅니다. 이 기술은 수동 조작을 덜 필요로하고 안구 표면 손상을 줄입니다.

이 임상 장치에 의한 IC를 사용하여 안구 표면을 손상시키지 않으면 서 안구 표면 면역 세포를 분리 할 수있었습니다. 그림 1 은 IC가 수행 된 방법을 설명합니다. 샘플이 수집 된 곳과 다른 눈의 부위가 표시됩니다. 그림 2 는 10 건강한 컨트롤에서 수집 한 유동 세포 계측법의 대표 결과를 보여줍니다. 게이팅을 위해서는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 SSC와 7-AAD를 사용하십시오. 7-AAD - 세포는 살아있는 세포로 확인됩니다. 이 생균은 CD3 + 및 CD4 + 마커에 의해 특성화됩니다. 또한 CD4 + 및 CD4 - 개체군은 각각 CCR7 및 CD45RO 마커가있는 Naive, T EM , T CM 및 T EMRA 로 특징 지어졌습니다. CD3 + T 세포 중에는 인간의 안구 표면에서 이펙터 기억 T 세포가 우세합니다. 이전 e에서또한, CD8 + 기억 세포가 건강한 개체 중 결막 상피 세포의 주요 개체군임을 보여 주었다. 그림 3 은 CD4 + 및 CD8 + 이펙터 메모리 T 세포 (T EM 및 T EMRA )가 연구 된 건강한 대조군 10 명에서 인간 안구 표면의 주요 하위 집합임을 보여줍니다. 그림에 언급 된 각 집단은 그들의 마커 표현형 및 이름 (Naïve, T CM , T EM , T EMRA )으로 통보됩니다. 빨간색 숫자는 인구의 비율을 나타냅니다. 이 도면의 데이터는 평균 ± SEM <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> 그림 1 : 인상 세포학 장치에 의한 안구 표면에서 IC 샘플 수집. 샘플은 측두엽으로부터 수집되었다ar 영역을 갖는다. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> 그림 2 : 유동 세포 계측법을 이용한 도트 플롯 그래프. 라이브 7-AAD - 세포가 선택되었습니다. CD3 + 세포는 먼저 문이 열리고,이 집단은 CD4 + 및 CD4 - 서브 세트로 게이팅되었다. 순진 (CCR7 + CD45RO - ), 중앙 기억 (CCR7 + CD45RO + ) 및 이펙터 메모리 (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) 부분의 비율은 CCR7 및 CD45RO 마커의 도움을 받아 결정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> 에프그림 3 : 건강한 인간 안구 표면의 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 면역 세포 하위 유형. 건강한 사람 대조군에서 결막 내 CD4 + 및 CD8 + naive, central memory (T CM ) 및 effector memory (T EM 및 T EMRA ) 하위 집합의 분포 ; 각 데이터 포인트는 별도의 개별 평균 ± SEM을 나타냅니다. 인구의 비율은 각 인구의 이름 아래에 빨간색으로 표시됩니다. CD4 + T EMRA 인구가 언급 된 산점도에 포함되지 않았기 때문에 전체 인구 비율은 98 %이다 (Bose 등 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다.

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K 조회수.  Nanyang Technological University.  노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다. 

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic의 비 침습 모델<em&gt; 대장균</em&gt; 신생아 쥐에 감염

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

비 침습적 기관 내 삽관 성인 쥐에서 전체 흉선

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...