We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.

윤리 문 : 이전 인체에서 세포를 수집에 대한 동의를 통보 윤리 승인을 취득해야합니다. 1. 얼룩 준비 주 : 실험의 날에 얼룩을 준비합니다. <ol><li> 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 2.5 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 5 ㎕를 에티 디움 (4 μM) 5 ㎕를 칼 세인 AM (4 μM)를 추가; 혼합. 사용할 때까지 RT에서 빛과 가게에서 보호하는 알루미늄 호일에 싸서. </li></ol> 2. 수집 세포 <ol><li> 자신의 패키지에서 세포 배양 삽입을 제거하고 각 눈꺼풀이 샘플링 될 때까지 레이블을 붙입니다. 영구 마커를 사용하여 막 플라스틱 홀더 측 셀 컬렉션 마크 방향. 행동은 IC를 받아야하는 지역의 적절한 건강을 확인하기 위해 적당한 배율 (약 20 배)에 램프 검사 슬릿. </li><li> EA의 하부 결막 낭에 국소 마취 (0.5 % proparacaine 염산염) 한 방울을 분배채널 눈과 눈을 유지하기 위해 참가자를 지시 한 분 마감했다. </li><li> 에버트 상부 눈 뚜껑과는 속눈썹에 의해 장소에서 개최; 뚜껑 와이퍼 영역과 접촉을 피하십시오. 옵션 : 보조 연구원의 도움이 단계를 수행해야 할 수 있습니다. </li><li> 최소 압력 뚜껑 와이퍼 영역의 중앙부에 수직으로 막을 적용한다. </li><li> 5 초 - 3의 장소에서 막 잡아. 접촉 영역에 반투명하게 막을 관찰한다. 이 시점에서, 부드럽게 막을 제거하고 다시 제자리에 &quot;플립&quot;하는 참가자의 뚜껑을 허용합니다. </li><li> 즉시 건조되는 것을 방지하기 위해, 샘플을 PBS 한 방울을 적용한다. 멤브레인은 반투명 설정하고이 건조를 나타냅니다으로, 언제든지 불투명 설정하지 않아야합니다. 보조 조사 샘플의 처리 (섹션 3) 즉시 진행해야합니다. </li><li> 결막의 무결성을 보장하기 위해 마지막 눈 검사를 실시한다. 안구 윤활제를 분배하고 참가자 지시마취 효과가 떨어져 착용 할 때까지 자신의 눈을 문지르고 피하기 위해 (약. 15 분). </li></ol> 3. 시료 처리 <ol><li> 마이크로 가위를 사용하여, 수직 셀 컬렉션의 중앙을 통하여 반 (하류 분석 각 절반)에서 멤브레인을 잘랐다. 플라스틱 홀더에서 분리하는 한 막 절반의 외연을 따라 절단; 막 자체에 접하지 않는 보장을 포함하는 막에 수집 된 세포와의 상호 작용을 피하십시오. </li><li> 완전히 홀더에서 분리하기 전에 핀셋을 사용하여 멤브레인을 고정합니다. 95 % (v / v)의 에탄올 500 μl를 포함하고 (4.2 절)을​​ 처리하기 전에 2 시간 최대 20 분의 최소 해결하기 위해 떠나라고 표시된 2 ML의 원심 분리기 튜브에 배치 막. </li><li> (3.2 절에 설명 된대로) 즉시 4.1 절을 진행 막의 즉시 별도의 후반. </li></ol> 4. 샘플 염색 <ol><li> Immunocytochemi칼 염색 <ol><li> 조심스럽게 수집면이 아래로 향하게 35mm의 유리 바닥 배양 접시에 막 배치; 멤브레인이 평평 확인합니다. </li><li> 피펫 막에에 부 (1)에 조립 된 면역 세포 화학 스테인 조성물의 20 μL. 샘플 컬 업,주의 깊게 가장자리를 아래로 밀어 막을 평평하게 일회용 피펫 팁을 사용하는 경우. 세포 수집 지역과의 접촉을 피하십시오. </li><li> 부드럽게 유리 커버 슬립으로 막 커버. 샘플의 불필요한 이동을하지 마십시오. 뚜껑 접시를 덮고 가장자리 주위에 랩 필름 밀봉. 접시 (상단과 하단) 및 샘플의 가시성의 투명성을 방해하지 마십시오. 실험실 마커 레이블. </li><li> 즉시 영상 (5.1 절)을 진행 한 후 멤브레인의 나머지 절반의 세포 학적 염색 계속 4.2로 돌아갑니다. </li></ol></li><li> 세포 학적 염색 <ol><li> 점차적으로 천천히 튜브 U 증류수 500 μL를 첨가하여 막을 수화3.4 절에 고정하기위한 나오지. 피펫 팁에 흡인 내용을 여러 번 다음 내용을 제거, 혼합합니다. </li><li> 증류수 500 μl를 추가합니다. 몇 초 동안 서하자, 다음 제거합니다. 알 시안 블루 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 3 연속 500 ㎕의 증류수 린스 또는 액체 분명 린스까지 수행합니다. </li><li> 헤 마톡 실린 # 1 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 세 개의 연속 500 μL를 증류수 린스를 수행하거나 액체는 명확 린스까지. 맑은 액체를 흡입하여 (섹션 4.2.1의 역)를 탈수. </li><li> 파파 니콜라 OG-6 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 한 500 μl의 95 % (v / v)의 에탄올 린스를 수행합니다. </li><li> 파파 니콜라 EA-65 얼룩의 500 μl를 추가하고 3 분 동안 둡니다. 얼룩을 제거하고 3 연속 500 μl의 95 %를 수행 (V는 / v)의 에탄올 린스. </li><li> 완전 세 개의 연속 500 ㎕를 100 % 에탄올 린스를 사용하여 탈수. TWE를 사용하여ezers, 솔루션의 샘플을 제거; 감동 세포 수집 영역을 피하십시오. </li><li> 유리 슬라이드에 막 배치; 해당 셀 컬렉션 라인을 보장하는 것은 병렬 또는 이미징 동안 쉽게 정렬 마진을 슬라이드에 수직 중 하나입니다. </li><li> 100 % 에탄올의 드롭을 적용하고 유리 슬립으로 다룹니다. 즉시 영상 (5.2 절)를 진행합니다. </li></ol></li></ol> 5. 샘플 영상 <ol><li> 이미징 형광 면역 세포 화학 얼룩 <ol><li> 화상 획득 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 디지털 컬러 카메라를 구비 한 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 11 형광 현미경 (12)을 사용한다. 샘플에 배양 접시에 포함되지 인해 거꾸로 현미경이 필요할 수 있습니다. </li><li> 에티 디움 호모 다이머-1 (DNA의 존재 617분의 528 nm의 예 / 엠 최대 값)와 칼 세인 AM의 흡수와 방출 스펙트럼 (517분의 494 내지 E에 따라 현미경 (11, 12)을 설정X / 엠 최대). </li><li> (예를 들어, 2.5 배 목적) 현미경의 낮은 배율을 선택하고 디지털 이미징 시스템을 활성화; 컴퓨터 모니터에 표시되는 샘플을 관찰한다. </li><li> 관심의 세포 기능에 대한 샘플을 검사합니다. </li><li> 원하는 현미경의 배율을 선택 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득. </li><li> 기본 현미경 파일 형식 또는 압축되지 않은 파일 형식 (예를 들어, * .RAW, * .TIFF) 중 하나에 파일을 저장합니다. </li></ol></li><li> 이미징 세포 학적 얼룩 <ol><li> 화상 획득 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 디지털 컬러 카메라 장착 없음 필터 표준 실험실 명 시야 현미경을 사용한다. </li><li> 장소 및 현미경 무대에서 (단계 4.2.8에서) 잠금 유리 슬라이드. 필요에 따라 전체 촬상 과정에 걸쳐 100 % 에탄올 샘플 재수. </li><li> (예를 들어, 2.5 배 목적) 현미경의 낮은 배율을 선택하고 일을 활성화즉 디지털 이미징 시스템; 컴퓨터 모니터에 표시되는 샘플을 관찰한다. </li><li> 확인 셀 컬렉션 현미경 스테이지 제어의 X 또는 Y 축 중 하나와 정렬된다. 커버 슬립을 제거하고 피펫 팁이나 핀셋을 사용하여 샘​​플을 회전시켜, 필요하다면 조정한다. </li><li> 이미징 소프트웨어 최저 현미경 배율 전체 샘플의 캡쳐 된 이미지 (들)를 사용. </li><li> 보통 현미경 배율로 전환 (예를 들어, 10 - 20 배 목표) 및 현미경 광원 및 소프트웨어 이미징 매개 변수 (노출, 대비, 화이트 밸런스 등을) 조정 및 자동화 소프트웨어 계량을 사용하지 않도록 설정합니다. 나중에 사용하기 위해 이러한 설정을 저장합니다. </li><li> 스캔 (예를 들어, 왼쪽 상단 셀 컬렉션의 오른쪽 아래 모서리)의 시작과 끝 지점을 결정합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어의 시점과 종점 내의 전체 셀 집적 영역의 캡처 된 이미지 (들)를 사용. 20 % 나란히 및 위에서 아래로 중복 betw 확인모든 인접한 이미지 EEN. </li><li> 기본 현미경 파일 형식 또는 압축되지 않은 파일 형식 (예를 들어, * .RAW, * .TIFF)를 사용하여 파일을 저장합니다. </li><li> (예를 들어, 어도비 포토샵 요소) 선택의 자동 스티칭 소프트웨어를 사용하여 최종 파노라마 이미지를 생성합니다. 최종 이미지에 자동 스티치의 정확성을 확인하는 단계 5.2.5에서 찍은 사진 참조 이미지)를 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors have no relevant funding or conflicts to disclose.

노출은 통상적 세포학 혼합 셀룰로오스 에스테르 막을 사용하여, 구 결막에 대해 수행된다. 샘플, 대량 재료의 시트에서 크기로 잘라 멸균 집게를 사용하여 결막 표면에서 적용되고 제거됩니다. 동일한 막 재료를 사용하여 피스톤 제어 IC 디바이스의 최근 어플리케이션 (13) 사이 일관된 압력을 구 결막의 표면 형상과 일치하고, 유지하도록 설계되었다. 이러한 접근은 지역 와이퍼 좁은, 눈에 띄게 곡선 뚜껑 비효율적이다 (그림 1 참조). 또한, 혼합 된 셀룰로오스 에스테르 막는 명 시야 현미경 형광 촬상 전에 샘플을 정렬 할 필요가 셋업에 필요한 투명성을 제공하지 않는다. 이 프로토콜에서 제시 세포 배양 삽입물은 이상적인 크기 멸균 신속한 수집을 보장하는 추가 장비없이, 수동으로 취급 될 수 있기 때문에 편리하다. 막은에서 만들어집니다공 초점 현미경 분석을위한 충분한 투명성을 제공 친수성 ​​PTFE. 전반적으로, 수집 된 세포의 형태 학적 특징은 이전의 문헌보고 7,8,14,15와 일치한다. 이후 파파 니콜라 우 염료, 미세한 색 변화를 표시 세포 각질화 수준에서보다 상세한 관점을 가능하게하는 알 시안 블루 일반적으로 사용되는 (그리고 색채 매우 강렬)과 요오드 산 - 쉬프 (PAS) 염색을 교체 7,8 이전에보고 된 것보다 수 있습니다. 세포 학적 시료의 현미경 영상은 일반적으로 비주얼 접안을 통해 검사하고, &quot;관심&quot;것으로 간주 구조의 고배율 사진을 포함한다. 이 방법, 전체 컬렉션의 &quot;큰 그림&quot;측면이 손실 될 수 있습니다. 저배율 샷은 일반적으로 (인해 등 비네팅, 수차에) 열등한 광학 품질의 해상도는 휴대 세부 묘사 부족에스. 이 막 전체의 개요뿐만 아니라 핵 세부를 확대하는 기능, 하나의 이미지 모두를 제공하기 때문에 소비 조금 더 시간이 유리한 반면 파노라마 스티치 프로토콜은 여기에 제안 하였다. 이러한 세포 수 등 양적 지표는 핵 세포질 (NC) 비 (16)와 거리가 여기에 계산 될 수있다. 샘플 처리 단계 (섹션 2.6 ~ 5 세) 및 최적의 파노라마 스티칭에 대한 일관된 이미지 매개 변수 사이의 올바른 결막에 멤브레인의 응용 프로그램 (2.4 절), 타이밍 (섹션 5.2 : 특별한주의를 필요로하는 프로토콜 내에서 세 가지 중요한 단계가 있습니다 0.6 - 5.2.8). 표피와 눈꺼풀 고랑 사이에 2mm - 상대적으로 평면 구 결막과는 달리, 지역 와이퍼 뚜껑은 1의 좁은 폭에 걸쳐, 뚜렷한 곡률을 가지고있다. 이 크게 수집 세포의 형태에 영향을 미칠 수는 멤브레인이 정확한 각도로인가되는 것이 중요하다. 둘째, MEMbrane 압력은 응용 프로그램 간의 일치해야한다. 조사관 따라서 반복 컬렉션을 보장하기위한 필요한 손재주를 개발해야한다. 샘플이 노출 세포학 기술을 사용하여 수집되면, 처리의 타이밍이 매우 중요해진다. 샘플이 건조하도록 허용해서는 안, 즉, 멤브레인은 불투명 (섹션 5를 통해 2.6, 3)가되지해야합니다. 세포 학적 염색 받아야하는 샘플 장시간위한 정착액에 남아있을 수 있지만 (20 분 - 2 시간)은 면역 세포 화학적 오염이 추가되어야하고, 가능한 한 정확하게 세포 생존율을 평가하기 위해, 지연없이 묘화. 타이밍의 일관성은 샘플 간의 비교 결과에 필수적이다; 하나는 모든 샘플을 비교하는 동일한 고정 및 염색 시간을 유지하는 것을 목표로한다. 마지막으로, 세포 검사 시료의 정성 파노라마 이미지를 얻기 위해, 모든 이미지 파라미터들 (광 강도 현미경 카메라를 노출, 콘트라스트, 화이트 밸런스 등)관심의 기능 (즉, 세포 유형)의 가장 높은 다양성, 모든 자동화 된 측정과 시료의 대표 지역으로 교정해야 이후 촬영 (섹션 5.2.6) 중지 될 수있다. 조사관은 또한 X 또는 현미경 스테이지의 Y 축 중 하나에 맞춰 셀 컬렉션의 방향을 목표로한다. 이 화상 취득 스티치 과정을 쉽게한다. 찾아 인접한 이미지들 사이의 중첩 영역에서의 샘플 (예를 들어, 셀 패치 meibum 찌꺼기 등)에 특징적인 기능을 사용하고자합니다. 현미경 포커스 촬영 사이 수정 될 유일한 조절되어야한다. 원래 뚜껑 와이퍼 세포 융합 패치 입수의 67 % 성공률을보고 Jalbert (8)에 의해 관찰이 기술의 제한은 세포 콜렉션의 변동에있다. 애플리케이션 각 수집 세포의 수 및 유형을 지시한다. 이 단계에서 그것은 w 불확실hether 컬렉션 품질 (즉, 시료의 세포 수) 안구 상태와 상관된다. 보다 큰 샘플 크기 임상 시험이 기술의 유효성을 증명하기 위해 필요하다. 또 다른 단점은 IC 기술 자체의 고유의 침입에있다. 뛰어난 휴대 층은 강제 결막에서 제거되고이 손상을 야기 할 수 있음. 면역 세포 화학 얼룩이 세포 생존율 (및 에스 테라 제 활성 모든 컬렉션에 존재)를 반영하기 위해 의도 된 반면, 장서 세포 핵의 적색 형광을 나타내는 불분명하다. 때때로 meibum (즉, 리드 여백 분비 지질) 안구 표면 또는 눈물 막에서 다른 구성 요소는, 셀룰러 기능을 포함하고 분석이 어렵거나 불가능하게하는 경향이있다. 이 프로토콜은 meibum 지질을 제거하는 크실렌의 추가 린스로 수정 될 수있다. 마지막으로, 결막 세포 마취 방울의 효과는 알려져 있지 않다. 뚜껑 와이퍼 영역의 세포 구조의 데이터를 획득하는 것은 이들 세포 및 안구 표면과 주관적 시설 사이에 발생하는 마찰력 사이의 상관 관계를 확인할 수 있도록한다. 이 가치있는 지식을 제공하고 콘택트 렌즈 착용자의 세포 특수성을 탐구하는 미래의 임상 시험을 허용한다, 무증상 환자는 달리 뚜껑 와이퍼 epitheliopathy, 안구 건조 또는 건조 증상을 가진 환자는 희망 안구 불편 주제에 광명을 비춰합니다.

2mm 좁은 결막 지역 안구 세계를 반대 - 인간의 위 눈꺼풀 단지 1로, 1 만 깜박 매일 1 주위를 실행합니다. 깜짝 동안의 와이 핑 동작으로 인해, 뚜껑 마진이 부분은 ​​&quot;뚜껑 와이퍼&quot;영역 (2)로 명명되었다. 이는 마찰에 의한 지구 위로 닦아 뚜껑에 습관적 깜박임 동안이 영역에서 증가하는 것으로한다. 이는 안구 시설에 중요한 역할을 할 수있다. 콘택트 렌즈는 특별한 경험 안구 불편에 착용자이 렌즈는 3 착용 중단의 주요 원인 중 하나입니다. 콘택트 렌즈는 눈에 위치 될 때 렌즈 재료 및 안구 표면 사이의 마찰 계수 4를 변경하는 것으로 나타났다. 건조 현상이 변경된 마찰 2,5,6- 관련 될 수 있음을 시사하는 증거가있다. 이 협회는 또한 임상 적으로 관찰 가능한 현상에 반영 될 수 있으며, 특히 뚜껑 위스콘신epitheliopathy (LWE)라고도 상부 덮개 마진 염색 (ULMS) 6 당. LWE은 안구 자극의 초기 기호 및 안구 건조 질환을 유발할 수있는 위험이 예측이다. 이 관찰 상하 뚜껑 마진 영역 생체 염색에 의해 측정된다. 이 등급 시스템 (2) 및 임상 적 유효성 (즉, 자각 증상과 상관 관계가) 논쟁에서 여전히 있지만, 안구 불편 함이 모두 의사와 과학자에 대한 수수께끼를 유지하고, 가장 중요한, 환자의 불편. - 날짜, 작은 뚜껑 와이퍼 영역 (7)의 (서브) 세포 해부학과 생리학에 임상 적으로 관련 변화에 대해 알려진 단 하나의 보고서는 세포 학적 방법 (8)을 사용한다. 노출 세포진 검사 (IC)는 막 9,10의 응용 프로그램에 의해 안구 또는 눈꺼풀 결막의 상피 표면에서 세포를 수집하기 위해 40 년 이상 사용되어왔다. 제거시, 부착 세포는 C를 거쳐ytological 염색 및 현미경 영상. 때문에 뚜껑 와이퍼 영역의 해부학 적 및 세포의 차이로,이 기술은 최적화를 필요로한다.

<table><tbody><tr><td>Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid</td><td>Sigma</td><td>B8438-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin, Gill 1</td><td>Sigma</td><td>GHS116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, OG-6</td><td>Sigma</td><td>HT40116-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, Modified EA</td><td>Sigma</td><td>HT40232-1L</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L-3224</td><td>contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes</td></tr><tr><td>Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert, 12&amp;nbsp;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Bottom Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

impression cytology of the lid wiper area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

플라스틱 홀더 위에 스팬 세포 배양 막은 덮개 와이퍼 결막 상피 세포에서의 핸드 헬드 컬렉션 편리한 도구이다. 이 방법은 일반적으로 제조 및 IC 막을 처리하는 데 추가적인 멸균 장비에 대한 필요성을 제거한다. (1) 세포 배양 삽입물을 이용하여 뚜껑 와이퍼 영역의 IC를 보여주고있다. 우리는 새로운 방식으로 뚜껑 와이퍼 영역에서 상피 세포의 특성을 서로 보완 개의 상이한 염색 프로토콜을 최적화. 도 2에 도시 된 바와 같이, 형광 면역 조직 화학적 염색은 에스 테라 제 활성, 세포 생존의 지표 및 핵산 공개, 염색있는 세포막 손상을 반영한다. 세포 학적 염색 프로토콜 각질화도 사이의 미세한 차이에 대한 허용한다.도 3으로 천이를 도시 눈꺼풀 결막 및 고급 각질 낮은 각질화 사이뚜껑 와이퍼 결막 및 표피 화. 선택된 관심 영역 반대로 세포학 염색 세포 콜렉션의 파노라마 영상은 전체 집적 영역의 분석을 허용한다. 이미지 해상도는 핵 수준으로 확대에 적합; 세포 형태를 정밀하게 측정 할 수있다. (4)이 약 사용하여 함께 렸 미세 침 흡인 세포 검사 스테인드 셀 컬렉션의 마지막 이미지를 보여줍니다. (100) 별도의 고해상도 파일입니다. 이러한 툴은 새로운 방식으로 마찰 및 / 또는 안구 건조의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig1.jpg" /> 뚜껑의 그림 1. 노출 세포학은 와이퍼 지역. 노출 세포학 상단 덮개의 외반에 의해 노출 된 뚜껑 와이퍼 지역에서 수행. 사용 막은 세포 배양 삽입, 12mm, 친수성 ​​PTFE이다. 미리 달리 유지 될 수 멤브레인 홀더의 탭 (참고그들은 좁은 눈꺼풀 마진 상에 멤브레인의 응용 프로그램을 방해하지 않고 실제로 정렬 도움이 될 수 그들이이) 응용 프로그램 이전에 제거 된 구 결막에 vious 연구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54261/54261fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig2.jpg" /> 뚜껑 와이퍼 영역으로부터도 2 형광 세포. 공 초점 레이저 주사 현미경으로 큰 편평 세포 사이의 세포 형태의 변화를 도시 (a) 및 작은 입방 형 / 기둥 형 셀 (b). 칼 세인 AM 녹색 형광 세포체 (즉, 세포 생존)의 에스 테라 제 활성을 나타낸다. 에티 디움의 적색 형광이 세포막을 손상 나타내는 핵산을 보여준다. 몇몇 세포는 강렬한 녹색없고 적색 형광 가능성에 표시<html> 세포막의 무결성 (C)의 dicative. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54261/54261fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig3.jpg" /> IC의 샘플 그림 3. 세포 학적 염색. 형태와 다른 각질화 학위를 변화 뚜껑 와이퍼 영역 쇼의 세포. 한계 / 눈꺼풀 결막에있는 큰 핵을 가진 작은 기둥과 입방 세포의 파란색은 더 각질화를 나타냅니다 (A); 뮤코 피부 접합 (MCJ / 마르크스 &#39;선)과 표피의 anuclear 세포의 응축 핵 대형 편평 상피 세포의 레드 / 오렌지 얼룩 고급 각질화 (c)를 나타냅니다. 뚜껑 와이퍼 결막 지역에서 과도 색상 (레드 / 블루)과 세포의 형태는 각질화를 제한하는 것이 좋습니다의 (​​b).g3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig4.jpg" /> 그림 4. 합성 이미지 뚜껑 와이퍼 셀 컬렉션입니다. 세포 학적 염색 후 뚜껑 와이퍼 영역의 노출 세포 검사는. 이미지는 약 사용 함께 물렸다. 100 개별 사진은 현미경 20X 목표로 촬영. (a)는 작은 원주 /를 눈꺼풀 / 한계 결막의 입방 상피 세포. 여기에 세포 블루 / 그린 / 퍼플 색상에는 각질화를 표시하지 전시; (b) 리드 와이퍼 결막 세포 영역간 형태학 및 염색 색상 전이 (a) 및 (c); (c) 상기 뮤코 피부 접합 / 마르크스 &#39;라인의 큰 편평 세포. 오렌지 얼룩 색상은 각질화의 어느 정도를 나타내고, 레드 / 핑크 후기 편평 상피 전환을 나타냅니다; (d)에 Meibum 인상; (E) anuclear 표피의 각질화 된 세포; (F) Goblet 세포 인상 또는 눈물 영화 뮤신. 아래쪽 화살표가 눈꺼풀 결막 영역을 나타내고, 위쪽 화살표가 외부 뚜껑을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54261/54261fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Impression Cytology of the Lid Wiper Area

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

뚜껑 와이퍼 지역의 인상 세포학

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.3K 조회수.  University of Waterloo. We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort. 

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Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of tissue samples from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsies has become a key tool for understanding the complexity of tumor immunology and discovering novel predictive biomarkers for cancer immunotherapy. Immunoprofiling analysis of tissues requires the evaluation of combined markers, including inflammatory cell subpopulations and immune checkpoints, in the tumor microenvironment. The advent of novel multiplex immunohistochemical methods allows for a more efficient multiparametric analysis of single tissue sections than does standard monoplex immunohistochemistry (IHC). One commercially available multiplex immunofluorescence (IF) method is based on tyramide-signal amplification and, combined with multispectral microscopic analysis, allows for a better signal separation of diverse markers in tissue. This methodology is compatible with the use of unconjugated primary antibodies that have been optimized for standard IHC on FFPE tissue samples. Herein we describe in detail an automated protocol that allows multiplex IF labeling of carcinoma tissue samples with a six-marker multiplex antibody panel comprising PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67, and AE1/AE3 cytokeratins with 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole as a nuclear cell counterstain. The multiplex panel protocol is optimized in an automated IHC stainer for a staining time that is shorter than that of the manual protocol and can be directly applied and adapted by any laboratory investigator for immuno-oncology studies on human FFPE tissue samples. Also described are several controls and tools, including a drop-control method for fine quality control of a new multiplex IF panel, that are useful for the optimization and validation of the technique.

A detailed protocol for a six-marker multiplex immunofluorescence panel is optimized and performed, using an automated stainer for more consistent results and a shorter procedure time. This approach can be directly adapted by any laboratory for immuno-oncology studies.

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

연구

암 연구학

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

신경과학

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

병아리 두개골 신경 볏 세포 배양의 준비 및 형태학적 분석

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

발생학

Anterior Segment HR-OCT를 사용한 안구 표면 편평 종양 평가

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. Traditionally, the diagnosis of OSSN relies on histopathological confirmation followed by a full-thickness biopsy. However, in the past two decades, the therapeutic approach to OSSN has shifted from surgical intervention to topical chemotherapy regimens in clinical settings. This shift emphasizes the need for less invasive or non-invasive methods to diagnose ocular surface pathologies. Among various imaging devices, commercially available high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) has emerged as a powerful tool for the characterization of OSSN. HR-OCT provides an in vivo, cross-sectional view of ocular surface lesions, offering an "optical biopsy" for OSSN with high sensitivity and specificity. It provides valuable information in differentiating intraepithelial or invasive OSSN from other benign lesions. Additionally, HR-OCT can be used to monitor the response to topical chemotherapy and to detect subclinical OSSN during follow-up visits. In this article, the scanning protocol for image acquisition is presented, and image interpretation for OSSN is outlined. This standardized, practical, and reproducible approach is recommended in clinical workflows and is expected to assist clinicians in the management of OSSN.

저자 스포트라이트: 안구 표면 편평 종양을 특성화하기 위한 비침습적 도구로서의 전방 HR-OCT

Anterior segment high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) is a promising non-invasive modality for the diagnosis and therapeutic evaluation of ocular surface squamous neoplasia (OSSN). Here, the system setup, scanning technique, and representative diagnostic results are presented.

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia(안구 표면 편평 종양의 진단 및 치료 모니터링에서 전방 고해상도 광학 간섭 단층 촬영)

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. ...

공학

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

면역학 및 감염병학

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &ndash; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed due to challenges with different diagnostic modalities. Ciliary videomicroscopy, using Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), one of the diagnostic tools for PCD, is considered the optimal method to perform ciliary functional analysis (CFA), comprising of ciliary beat frequency (CBF) and beat pattern (CBP) analysis. However, DHSV lacks standardized, published operating procedure for processing and analyzing samples. It also uses living respiratory epithelium, a significant infection control issue during the COVID-19 pandemic. To continue providing a diagnostic service during this health crisis, the ciliary videomicroscopy protocol has been adapted to include adequate infection control measures.
Here, we describe a revised protocol for sampling and laboratory processing of ciliated respiratory samples, highlighting adaptations made to comply with COVID-19 infection control measures. Representative results of CFA from nasal brushing samples obtained from 16 healthy subjects, processed and analyzed according to this protocol, are described. We also illustrate the importance of obtaining and processing optimal quality epithelial ciliated strips, as samples not meeting quality selection criteria do now allow for CFA, potentially decreasing the diagnostic reliability and the efficiency of this technique.

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &#8211; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

To guarantee a successful and high-quality ciliary functional analysis for PCD diagnosis, a precise and careful method for respiratory epithelium sampling and processing is essential. To continue providing PCD diagnostic service during the COVID-19 pandemic, the ciliary videomicroscopy protocol has been updated to include appropriate infection control measures.

디지털 고속 섬모 비디오 현미경을 사용한 비강 칫솔질 샘플링 및 처리 – COVID-19 전염병에 대한 적응

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

뚜껑 와이퍼 지역의 인상 세포학

요약

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맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측

병아리 두개골 신경 볏 세포 배양의 준비 및 형태학적 분석

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia(안구 표면 편평 종양의 진단 및 치료 모니터링에서 전방 고해상도 광학 간섭 단층 촬영)

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia(안구 표면 편평 종양의 진단 및 치료 모니터링에서 전방 고해상도 광학 간섭 단층 촬영)

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia(안구 표면 편평 종양의 진단 및 치료 모니터링에서 전방 고해상도 광학 간섭 단층 촬영)

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

디지털 고속 섬모 비디오 현미경을 사용한 비강 칫솔질 샘플링 및 처리 – COVID-19 전염병에 대한 적응

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜