암 치료의 심각한 장애물은 생리학적 장벽으로 인해 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 접근이 제한된다는 것입니다. 따라서, 약물 전달 효율을 향상시키기 위해 생물학적 장벽을 치료할 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발이 강력히 요구되고 있다. 이 절차의 목적은 향상된 세포 간 침투를 위해 순환 세포 침투 펩타이드를 합성하는 것입니다.
이 방법의 장점은 금속 촉매 없이 시스테인 및 수지와의 치환 반응을 통해 펩타이드 고리화를 쉽게 달성할 수 있다는 것입니다. 방향족 가교결합의 혼입은 친수성 락탐 또는 트리아졸 가교결합에 비해 펩티드의 전반적인 소수성을 향상시켜 투과성을 향상시킵니다. 시작하려면 흄 후드에 수동 펩타이드 합성 장치를 조립하십시오.
3방향 스톱콕을 진공 매니폴드에 놓고 질소에 연결합니다. 사용하지 않는 입구를 막아야 합니다. 10밀리리터 폴리프로필렌 컬럼을 3방향 마개에 부착하고 고무 피펫 전구 또는 폐기물 트랩을 통해 진공을 사용하여 폴리프로필렌 컬럼에서 반응 혼합물 또는 용매를 배출합니다.
펩타이드 합성을 위한 수지를 준비하기 위해 필요한 양의 수지에 4-5밀리리터의 DMF를 첨가하고 30분 동안 부드러운 질소 버블링으로 폴리프로필렌 컬럼으로 옮겨 수지를 적절하게 팽창시킵니다. DMF를 배출하고 수지에 4-5 밀리리터의 50 % 모르 폴린 / DMF를 첨가하십시오. 질소를 30분 동안 부드럽게 버블링하여 N-말단 Fmoc 그룹을 제거한 다음 혼합물을 배출합니다.
컬럼에 4 내지 5 밀리리터의 DMF를 첨가하고 매번 적어도 1 분 동안 질소로 버블 링하여 수지를 3 회 철저히 세척한다. 같은 방법으로 수지를 디클로로메탄으로 3회, DMF로 3회 세척한다. 다음으로, 648.8 밀리그램의 Fmoc 및 PBF 보호 아르기닌과 372.6 밀리그램의 HATU를 5 밀리리터의 DMF에 원심분리기 튜브에 용해시킨다.
348.4 마이크로리터의 DIPEA를 첨가하여 커플링 반응을 활성화하고, 반응 혼합물을 수지와 함께 폴리프로필렌 컬럼으로 옮긴다. 혼합물을 질소 버블링으로 1 내지 2시간 동안 부드럽게 교반한 다음, 커플링 반응을 한 번 반복한다. 반응 혼합물을 배출하고 DMF, 디클로로메탄, 그리고 다시 DMF로 순차적으로 적어도 1분 동안 각각 3회 세척한다.
Fmoc 보호기를 제거하고 다음 아미노산 결합을 진행하기 전에 앞서 표시된 절차에 따라 수지를 세척합니다. 다음으로, 아미노산 결합에 대해 표시된 것과 동일한 공정을 사용하여 FITC 라벨링용 스페이서로 베타 알라닌을 결합한 후, FITC, DIPEA 및 DMF의 혼합물을 암실에서 폴리프로필렌 컬럼에 추가하여 수지에 대한 펩타이드의 FITC 라벨링을 수행합니다. 반응에는 거의 8 시간이 걸립니다.
선형 펩타이드의 고리화를 수행하기 위해 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 디클로로메탄의 혼합물을 폴리프로필렌 컬럼에 2분 동안 첨가하여 시스테인의 트리틸 보호기를 선택적으로 제거한다. 혼합물을 배출하고 황색 용액이 무색이 될 때까지 절차를 반복하여 삼중 수소 보호기를 완전히 제거한다. DMF와 디클로로메탄으로 수지를 3회 이상 순차적으로 세척하고 DIPEA로 DMF에 4,4'비스-브로모메틸-비페닐을 용해시킵니다.
용액을 컬럼에 넣고 4시간 동안 반응시킵니다. 수지를 4 내지 5 밀리리터의 메탄올로 각각 5 분 동안 2 회 세척하고, 질소의 연속 흐름으로 건조시킨다. 시스테인을 함유하는 펩타이드의 경우, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 물 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 1,2-에탄디티올 및 물의 효과적인 절단 칵테일로 수지를 처리합니다.
펩티드 결합 수지를 2 내지 3시간 동안 처리하여 펩티드를 절단한 다음, 질소 스트림으로 트리플루오로아세트산을 조심스럽게 제거한다. 조 펩티드를 얻기 위해, 4 내지 5 밀리리터의 디 에틸 에테르를 쪼개진 펩티드 제제에 첨가하여 조 펩티드를 침전시키고, 10, 000 x g에서 4 분 동안 원심 분리한다. 상층액을 조심스럽게 버리고 효과적인 흄 후드에서 3분 동안 펩타이드를 자연 건조합니다.
소규모 조잡한 펩타이드를 800 마이크로 리터의 아세토 니트릴에 용해시킨 다음 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 및 액체 크로마토 그래피 질량 분석법을 사용하여 분석합니다. 조직 배양 플레이트 삽입물이 있는 12웰 챔버에서 DMEM 2밀리리터에 100, 000개의 HeLa 세포를 접종하고 5% 이산화탄소를 함유하는 섭씨 37도의 가습 배양기에서 24시간 동안 배양합니다. 배지를 제거하고, FBS가 없는 DMEM에서 10 마이크로몰 FITC-R8 또는 FITC-sR8-4와 함께 챔버에서 세포를 1시간 동안 인큐베이션한다.
그 후, 펩타이드가 포함된 배지를 제거하고 1 밀리리터의 PBS로 세포를 3회 세척하였다. 1밀리리터의 신선한 FBS가 없는 DMEM을 챔버에 추가한 다음 조직 배양 플레이트 삽입물과 함께 챔버에서 HeLa 세포를 공동 배양하고 HeLa 세포를 바닥의 둥근 커버슬립에 2시간 동안 함께 배양합니다. HeLa 세포를 2.5% 글루타르알데히드로 15분 동안 둥근 커버슬립에 고정한 다음 DAPI로 15분 동안 세포를 염색합니다.
마지막으로 형광 현미경으로 커버슬립의 HeLa 세포를 관찰합니다. FITC 표지된 선형 R8 펩타이드 및 FITC 표지된 스테이플 R8 펩타이드의 합성에 대한 개략도가 여기에 제시되어 있습니다. 선형 R8 펩타이드 및 스테이플 R8 펩타이드의 HPLC 및 MS 스펙트럼이 이 그림에 나와 있습니다.
스테이플 펩티드의 머무름 시간은 선형 유사체의 머무름 시간보다 실질적으로 더 길었으며, 이는 소수성 가교결합을 이용한 고리화 후 펩티드의 향상된 전체 소수성을 나타냅니다. 이 그래픽 이미지는 25% FBS가 존재할 때 선형 펩타이드와 스테이플 펩타이드의 안정성을 나타냅니다. 고리형 R8은 4시간 동안 FBS와 함께 배양한 후 77.3%의 온전한 상태를 유지하는 반면, 선형 R8은 대부분 분해되어 고리형 R8 펩타이드의 향상된 단백질 분해 안정성을 시사합니다.
3 마이크로몰 FITC 표지 선형 R8 펩타이드 및 FITC 표지 스테이플 R8 펩타이드와 함께 1시간 배양한 후 HeLa 세포 및 4T1 세포의 라이브 셀 형광 현미경 이미지가 여기에 표시됩니다. 방향족 가교결합을 갖는 고리형 R8로 처리된 세포는 선형 반응물로 처리된 세포보다 더 높은 세포내 형광을 나타냈다는 것을 알 수 있다. 유세포 분석에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
순환 R8이 향상된 세포 간 침투를 제공하는지 여부를 추가로 조사하기 위해 트랜스웰 모델을 사용하여 한 세포층에서 다른 세포층으로 펩타이드의 장벽 투과성을 시뮬레이션했습니다. 사이클릭 R8은 선형 R8 펩타이드보다 더 높은 트랜스-배리어 침투를 분명히 나타냈으며, 이는 세포 내 형광의 현저한 증가에 의해 나타났다. 시스테인 및 수지의 트리틸 그룹의 완전한 탈보호는 다음의 고리화 단계에서 중요하다.
게다가, 고리화 효율은 또한 입체 효과로 인한 펩타이드의 특정 서열과 길이에 따라 달라집니다. 이러한 경우, 더 낮은 로딩 용량 또는 고리화를 가진 수지를 사용하여 용액 상에서 희석된 농도 하의 펩타이드를 사용하는 것이 도움이 될 것입니다. 이러한 고리형 펩타이드는 선형 펩타이드에 비해 향상된 세포 간 투과성을 보여주었습니다.
우리는 그들이 생물학적 장벽을 정복할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있으며 약물 전달 분야의 추가 응용 분야를 위한 분자에 사용될 것이라고 믿습니다.
