이 프로토콜에서, 술 포늄 염은 특별한 근접성에서 단백질 시스테인과 반응하는 새로운 손으로 작용할 수있는 것으로 구성되었다. 이 기술의 장점은 이 반응이 빠르고 효율적이며 Met-촉매가 없고 펩티드를 안정화시키는 간단하고 효율적인 방법을 개발했다는 것입니다. 시작하려면 500 밀리리터 비커 또는 플라스크에서 20 % 피 페리 딘 또는 50 % 모르 폴린 및 DMF의 N- 말단 9- 플루 오리 닐-메틸 옥시 카르 보닐 탈보호 용액을 준비하십시오.
그런 다음 10 밀리리터의 탈보호 용액을 컬럼에 첨가하고 질소를 버블링하여 용액에 30 분 동안 또는 5 분 동안 두 번 첨가합니다. 진공 펌프로 용액을 배출하고 디클로로메탄과 N,N-디메틸포름아미드로 5회 순차적으로 수지를 세척한다. 수지를 짙은 황색 용액으로 감지하려면 소량의 수지에 1 밀리리터의 N, N- 디메틸 포름 아미드를 첨가하고 유리관에 200 마이크로 리터의 5 % 닌히 드린을 첨가하십시오.
수지 색상의 변화를 평가하기 위해 섭씨 130도에서 3분 동안 가열합니다. 펩티드의 커플 링을 위해, 폴리 프로필렌 튜브에 원고에 설명 된대로 혼합 용액을 준비하고 3 밀리리터의 N, N- 디메틸 포름 아미드에 용해시킨다. 이어서, 173 마이크로리터의 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 154 마이크로리터의 N,N'디이소프로필카르보디이미드를 용액에 첨가하여 아미노산을 불활성화시킨다.
다음으로, 혼합물을 수지와 함께 컬럼에 첨가하고 질소로 2 시간 동안 거품을 낸다. 커플 링 후 소량의 수지에 1 밀리리터의 N, N- 디메틸 포름 아미드를 첨가하고 유리관에 200 마이크로 리터의 5 % 닌히 드린을 첨가합니다. 수지가 무색으로 변하는 동안 섭씨 130도에서 3 분 동안 가열하여 탈보호 단계 전에 유리 아미노기가 없음을 확인합니다.
용액을 배출 한 후, 이전에 설명 된대로 수지를 세척하고 10 밀리리터의 탈보호 용액을 컬럼에 첨가한다. 그런 다음 질소로 30 분 동안 거품을 내거나 5 분 동안 두 번 거품을 일으 킵니다. 그리고 다시, 신선한 솔루션을 추가하십시오.
탈수 용 수지가있는 컬럼에 무수 메탄올 10 밀리리터를 넣고 다음 사용을 위해 질소로 건조시킵니다. 수지 100 밀리그램의 무게를 컬럼에 넣고 커플 링 단계 전에 디클로로 메탄과 N, N- 디메틸 포름 아미드로 수지를 세척하십시오. 보호기를 제거하기 위한 100밀리리터 비커 또는 플라스크에 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 디클로로메탄 혼합물을 첨가하여 트리틸-L-시스테인 보호기를 제거하기 위한 용액을 제조한다.
준비된 용액 5 내지 10 밀리리터를 컬럼에 첨가하여 10분 동안 보호기를 제거하였다. 노란색이 완전히 사라질 때까지 질소 버블 링으로 6 번 반복하십시오. 진공 펌프로 용액을 배출한 후 앞에서 설명한 대로 수지를 세척합니다.
이어서, 50 밀리리터 비커 또는 플라스크에 디 할로겐화 링커 및 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민을 N, N- 디메틸 포름 아미드로 첨가하여 탈 보호 된 시스테인과 반응하기위한 용액을 제조한다. 5 내지 10 밀리리터의 반응 용액을 컬럼에 첨가하여 질소 버블 링으로 적어도 3 시간 동안 보호 된 시스테인과 반응시킨다. 다시 진공 펌프로 용액을 배출하고 앞에서 설명한 대로 수지를 순차적으로 세척합니다.
펩티드 고리화 용액을 준비하려면 트리플루오로아세트산 혼합물을 20밀리리터 비커 또는 펩티드 고리화를 위한 흄 후드의 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 5-10 밀리리터의 혼합 용액을 폴리 프로필렌 튜브에 넣고 트리플루오로 아세트산 칵테일 아래에서 수지를 3 시간 동안 절단합니다. 커플링 단계가 이전에 입증되기 전에 수지를 탈수 및 세척한 후, 1%포름산 수용액과 1밀리몰 프로파길 브로마이드를 제조하고 메티오닌 펩타이드 용액에 첨가한다.
다음으로, 메티오닌과 프로파길 브로마이드의 커플링 반응을 실온에서 12시간 동안 흔들어 준다. 반응 후, 생성물을 폴리 프로필렌 튜브와 아세토 니트릴에 녹이고 0.22 마이크로 미터 필터 멤브레인을 통해 여과한다. 그런 다음 즉시 역상 HPLC로 용액을 정제하고 다음 사용을 위해 분말로 동결 건조합니다.
시스테인과 메티오닌 사이의 비스-알킬화를 사용하여 합성된 사이클릭 펩티드는 HPLC 및 LCMS 스펙트럼에 의해 특성화되었으며, 이는 에피머가 뚜렷한 머무름 시간 및 동일한 분자량을 나타냄을 보여준다. 에피머와 그 접합 생성물의 HPLC 트레이스는 고리형 펩타이드와 그 생성물 사이의 시간 의존적 전환을 입증했습니다. 티올-인형 반응을 이용하여 합성된 고리형 펩타이드의 분자량은 LCMS에 의해 결정하고, 펩타이드는 HPLC에 의해 분리 및 정제하였다.
펩타이드는 양성자 NMR 및 이종 핵 단일 양자 간섭 스펙트럼에 의해 추가로 특성화되어 화학적 이동을 나타냅니다. 고리형 펩타이드와 디티오트레이톨 및 산화중수소 사이의 시간 의존적 전환의 양성자 NMR 스펙트럼을 얻어 술포늄 고리의 개방에 의한 펩타이드의 안정성을 탐색하였다. 결과는 24시간 후에 첨가 또는 개환 생성물이 형성되지 않았음을 보여주었다.
이 절차는 고리 형 펩타이드를 합성하기위한 효과적인 전략을 수립했습니다. 상기 반응은 고리화 펩티드를 안정화시킨다는 것을 형성함으로써 선택성도 향상되었다고 말하며, 이는 고리형 펩티드가 유망한 약물 촉매임을 나타낸다.
