저자가 도움이 토론에 대한 우리 부부는 플레밍과 제시카 첸 감사하고 싶습니다. 자금은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIH - NIAID) 수상 R15AI079685 및 연구 회사 Cottrell 대학 과학 수상에 의해 제공되었다. 추가 학생 지원은 하워드 휴즈 의학 연구소와 스탤리가 기금에​​ 의해 제공되었다.

1. 대형 Unilamellar 지질 Vesicles (LUVs)의 준비 <ol><li> 세포막의 분석 19 싫어하지 &#39;역할을 LUVs를 준비합니다. </li><li> 믹스 phosphatidylcholine (POPC, 760.10 g / 몰), phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 g / 몰), 5 dimethylaminonaphthalene - 1 - sulfonyl 50 클로로포름에 용해 phosphatidylethanolamine (DNS - 포프, 994.350 g / 몰) (아벤티 폴라 Lipids) : 45:5 비율. 모든 분석은 실험 및 제어 모두 LUVs의 별도의 준비가 필요합니다 마찬가지로 두 개의 지질 케이크 유리병을 준비한다. 총 지질 (0.188 MG POPC, 0.169 MG의 POPG, 그리고 0.019 MG DNS - 교황)의 0.376 MG는 일반적으로 하나의 translocation 시험에 대한 충분한 vesicles를 만들기 위해 충분하다. </li><li> N 2 가스 스트림을 사용하여 클로로포름에서 증발. </li><li> 지질 케이크에게 진공 건조기에서 9~14시간을 건조. </li><li> 주식 10 MM의 HEPES 버퍼 솔루션 (10 MM의 HEPES, 238.3 g / 몰, 45 MM NaCl, 58.44 g / 몰, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 372.24 g / 몰 산도 7.4) 준비합니다. HEPES 완충액은 일입니다4 ° C.에 ored </li><li> 위의 준비 10 MM HEPES 버퍼에서 0.4 mm까지 돼지의 트립신 (23.3 ㎏ / 몰)의 주식 솔루션을 준비합니다. 트립신은 -20 ° C에서 저장되고, 우리의 실천, 보통 사용하기 전에 2 개 이상의 동결 - 해동주기를 받아야하지 않습니다. </li><li> -20 ° C. 10 MM의 HEPES 버퍼 솔루션과 저장소에있는 4.0 밀리미터 보먼 - Birk 트립신 억제제 (8 ㎏ / 몰)의 주식 솔루션을 준비 우리의 사용이 주식은 매월 보충함하고 그것이 다시 만들어지기 전에 보통 3 개 이상 동결 / 해동주기를 받아야하지 않습니다. </li><li> 0.4 MM 트립신 재고 및 말린 지질 케이크 10 MM HEPES 버퍼 솔루션의 동일한 볼륨을 추가하여 0.2 MM의 트립신 솔루션 Reconstitute 실험 multilamellar vesicles (MLVs). 0.376 MG 총 지질의 단일 샘플 들어, 트립신 솔루션과 HEPES 완충액 150 μL의 150 μL의 혼합물은 충분합니다. </li><li> 0 동등한 볼륨을 추가하여 0.2 MM 트립신 및 2.0 MM 보먼 - Birk 트립신 억제제와 솔루션에 Reconstitute 제어 MLVs.4 MM 트립신 재고 및 말린 지질 케이크 4.0 MM 트립신 억제제. 0.376 MG 총 지질의 단일 샘플 들어, 트립신 솔루션과 트립신 억제제 150 μL의 150 μL의 혼합물은 충분합니다. </li><li> 유리 튜브에서 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송 MLV 솔루션. </li><li> 액체 질소 5 동결 / 해동주기에 따라 MLV는 솔루션을 제공합니다. </li><li> 각 테플론 압출기 기사에 HEPES 버퍼에 moistened이 필터 지원을 배치하여 지질 압출기를 (아벤티 폴라 Lipids) 준비합니다. 두 테플론 압출기 조각 사이에 0.1 μm의 모공 (워트 먼지, 영국)와 nuclepore 트랙 새겨져 멤브레인를 삽입하고 금속 압출기 용기 내부의 압출기의 조각을 넣으십시오. 압출기 용기의 금속 위로 강화하고 홀더에 넣어 전에 두 압출기 조각을 통해 도넛 스페이서를 넣으십시오. </li><li> 소포 샘플의 손실을 방지하기 위해 250 μL 유리 주사기를 사용하여 500 μL 10 MM의 HEPES 버퍼와 압출기 내에서 무효 볼륨을 채우십시오. &lt;/ 리&gt; <li> 압출기에 각 MLV 샘플을로드하고 세포막을 통해 균일한 unilamellar 소포 크기를 보장하기 위해 최소한 21 번 샘플을 누르십시오. LUVs은 MLV 솔루션 다음 압출에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 4 저장 LUVs ° C 및 48 시간 이내에 사용합니다. </li></ol> 2. Quantifying은 집중력 LUV <ol><li> LUV 농도는 샘플 20 전체 인의 함량을 결정하여 계량했다. </li><li> 상온에서 nanopure 물 저장 4 SO 8.9 NH 2를 준비합니다. </li><li> 2.5 % W / V 암모늄 molybdate VI (588.04 g / 몰) nanopure 물의 솔루션을 준비합니다. 10 % W / V 아스코르비 산 (176.1 g / 몰) nanopure 물의 솔루션을 준비합니다. 튜브 호일로를 덮고하여 빛의 노출에서 아스코르비 산 솔루션을 보호할 수 있습니다. 최대 2 개월 동안 4 ° C에서 두 솔루션을 저장합니다. </li><li> 0.65 MM 인산 버퍼 솔루션 (일염기의 무수 인산 나트륨, 120g / 몰) 준비합니다. </li><li> 여섯 표준 부엉 준비bes. 표준 0.0 μL, 50 μL (0.0325 μmoles), 100 μL (0.065 μmoles), 175 μL (0.114 μmoles), 250 μL (0.163 μmoles) 또는 인 솔루션의 350 μL (0.228 μmoles)를 포함해야합니다. </li><li> 세중의에서 샘플 튜브를 LUV 준비합니다. 각 샘플 튜브 LUVs의 약 0.1 μmoles를 포함해야합니다. 실험 및 제어 농도가 별도로 측정해야합니다 LUV. </li><li> 보먼 - Birk 억제제 가루에 말린 인의 소금에 대한 해결하려면 컨트롤 빈이 준비되어야합니다 LUV. 샘플 튜브 LUV 컨트롤에 배치되면서 빈은 0.2 MM MM trypsin/2.0 보먼 - Birk 억제제 솔루션의 동일한 볼륨을 포함해야합니다. </li><li> 표준 샘플, 그리고 빈 튜브의 각에 8.9 NH 2 SO 4의 장소 450 μL. </li><li> 175-210에서 열 샘플, 표준, 25 분 동안 공백 ° C 오븐에. </li><li> 모든 튜브를 제거하고 괜찮아 수 있습니다. 부엉의 각 30 % H 2 O 2 150 μL 추가bes. </li><li> 열 샘플, 표준 및 175-210에서 30 분 여백 ° C. </li><li> 샘플, 표준 및 열을에서 공백을 제거합니다. 솔루션 중 하나가 아직 무색하지 않은 경우, 175-210시 추가 15 분 동안 모든 튜브와 열 ° C. 50 μL H 2 O 2를 추가 </li><li> 3.9 ML nanopure H 2 O, 0.5 ML의 암모늄 molybdate 솔루션과 각각의 튜브에 0.5 ML의 아스코르비 산 솔루션을 추가합니다. </li><li> 끓는 물에 목욕에 5~7분 모든 튜브를 가열. </li><li> 애질런트 8453 UV - 보이는 분광 광도계를 사용하여 820 nm의 각 표준 및 시료의 흡광도를 측정. 0.0 mmoles의 인을 포함하는 튜브는 모든 표준 및 실험을위한 빈으로 사용해야하는 것은 샘플을 LUV. 0.2 MM MM trypsin/2.0 보먼 - Birk 억제제 솔루션을 포함하는 튜브 컨트롤의 빈으로 사용해야하는 것은 샘플을 LUV. </li><li> 선형 흡수 대 인 콘텐츠 표준 곡선은 생산 전체 phosph를 계산하는 데 사용할 수 있습니다orus 내용과 샘플의 농도를 LUV. </li></ol> 3. 펩타이드 솔루션을 준비 <ol><li> nanopure H 2 O.의 펩타이드를 해산 설명한대로이 분석에 사용되는 펩티드 하나 트립토판 잔류물을 포함해야합니다. </li><li> 세중의에서 282 nm의에서 펩타이드 솔루션의 흡광도를 측정. 5700 M -1 cm -1의 트립토판을위한 어금니 흡광 계수를 사용하여 펩타이드 농도를 계산합니다. </li><li> 30 μm의의 최종 농도 nanopure 물의 펩타이드를 희석. -20 ° C에 보관 </li></ol> 4. Translocation의 부량 <ol><li> 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브의 실험 및 제어 샘플을 준비합니다. 250 μm의의 최종 농도는 각 솔루션에 충분한 LUVs를 추가합니다. 그 억제제가 트립신 농도보다 큰 10X 최종 농도가되도록 충분히 보먼 - Birk 억제제 솔루션을 추가합니다. 450 μL에 최종 솔루션 볼륨을 가지고 충분한 10 MM의 HEPES 버퍼를 추가합니다. </li> &lt;Starna 마이크로 쿼츠의 fluorometer 전지로 리&gt; 소 50 μL 펩타이드 솔루션입니다. LUVs과 펩타이드 사이의 비율은 아무도 소포로 translocated없는 경우에도 거의 모든 그대로 펩티드가 무서워에게 신호를주는 dansyl 그룹에 가까운 정도로 가까이에있는 것을 보장하기 위해 충분히 높습니다. 이것은 유사한를하고 vesicles로 이동시키다하지 펩티드​​에 대한 컨트롤 상태에서 관찰 걱정과 일치합니다. </li><li> cuvette에있는 펩타이드 솔루션 실험 또는 제어 샘플을 추가합니다. 이 3 μm의하는 최종 펩타이드 농도를 가지고해야합니다. </li><li> 초당 최소 한번은 형광 독서를 복용, 실험이나 제어뿐만 아니라 즉시 25 분 형광등 속도론 실험 솔루션을 LUV을 시작합니다. 25-280 nm의에서 여기 파장 525 nm의에서 방출 파장과 온도를 설정 ° C. 캐리 이클립스 형광 분광 광도계를 사용하여, 우리가 고등에게 PMT 감도를 설정할 수 있습니다. </li></ol><html> 5. 양적 Translocation 비율을 생성 <ol><li> 데이터 수집의 십오초 후 형광 읽기로 초기 형광 (F O)를 정의합니다. 우리 악기 설정에서, 우리는 수집된 형광 데이터의 첫 번째 15 초 샘플 추가시 시스템에 샘플 챔버를 닫고, 다른 perturbations, 때문에 혼합하기 위해 신뢰할 수있는 것으로 나타났습니다. 각각의 시점에 상대 형광을 (F / F 0) 취득 F O 각 후속 독서를 나누십시오. </li><li> 평균 실험의 마지막 순간에서 모든 상대적인 형광 수치가 최종 평균 상대 형광을 얻기 위해 <img alt="[F / 정] 평균" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> 을 나누기 <img alt="[F / 정] 평균" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> 에 의해 제어 샘플 <img alt="[F / 정] 평균" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> 실험 샘플 수정 최종 형광 값을 얻을 수 있습니다. </li></ol>르 &quot;&gt; 6. 대표 결과 그림 2는 강력한 translocation을 보여준 대표적인 펩타이드이 분석의 결과를 보여줍니다. 이 실험 (검은색 추적)의 신호는 시간이 지남에 따라 신호를 걱정에 표시된 드롭을 보여줍니다. 그러나, 그것은 불완전 트립신 억제 또는 translocation의 능력과 관계없는 기타 요인으로 인해 신호를 걱정의 가능성 손실을 제어하는​​ 것이 중요합니다. 이를 위해, 우리는 항상 또한, 펩타이드 및 트립신과 보먼 - Birk 트립신 억제제 (회색 추적, 그림 2)를 모두 포함하는 LUVs 사이의 신호를 무서워 측정합니다. 우리 손으로, 그것은 실험이 실행될 때마다 모든 펩타이드에 대해이 컨트롤을 수행하는 것이 중요했습니다. 이것은 우리가 명확하게 지질 소포를 준비하거나 일반적으로 이러한 농도에서 관찰 상대적으로 약한 형광 신호를 미칠 수 있습니다 악기 소음, 사이에 차이로 인해 신호의 변경 사항에 대한 정확한 수 있습니다. 컨트롤 expe의 중요성트립신 억제제를 포함하는 LUVs를 사용 riment는 그림 3에 표시된 데이터로 강조 표시됩니다. 이 경우에는 펩타이드 신호 실험 샘플 (블랙 추적)의 그림 2에서와 비슷한 금액을 감소. 그러나, 컨트롤 샘플이 펩타이드에 대한 좀 더 빠른 감소를 보여주는 그물 translocation이 낮은 그럼. 우리의 프로토콜 제 5 본 실험에서 translocation을 quantifying위한 간단한 방법을 설명합니다. 높은 translocation 비율 효율적으로 이동시키다 펩티드 지표되며 그림 2에 표시된 세포 관통 펩티드에 대한 translocation의 비율은 1.16이며, 약하게 translocating 펩티드가 가까이 1 translocation 비율을 가지고있는 동안. 우리의 경험에서, 다른 소포의 준비와 수행 세 독립적인 실험에 대한 표준 오차는 0.01-0.06의 범위에 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> 그림 1. translocat의 개략도이온 분석. 실험은 샘플 (A)가 형광등 dansyl 교황 (검은 막대)와 도핑된 있으며, 트립신 (가위)를 포함하는 캡슐 LUV. 트립신 억제제 (빨간색 동그라미)은 LUVs 외부 트립신을 억제하는 데 사용됩니다. LUVs는 펩타이드 (보라색)에 노출되어 있습니다. 과 펩타이드 협회가 translocting 펩티드는 노골적인 내부 트립신 발생으로 감소 신호 (녹색)을 걱정 세포막의 산출을 LUV. 트립신과 트립신 억제제가 모두 통제 캡슐 아르는 (B) translocation 관련없는 신호를 걱정의 감소를 측정하기위한 샘플을 LUV. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> 그림 2. 세포 관통 펩티드에 대한 대표적인 데이터. 항균 pepide을 translocating 대표는 제어에 비해 신호를 걱정에 큰 방울을 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> 그림3. 컨트롤의 중요성을 강조 대표 데이터. 않은 translocating 펩타이드의 tryptic 소화가 완전히 억제는 실험과 제어 모두에서 시간이 지남에 따라 신호를 걱정에서 드롭으로 연결 솔루션을 LUV. 제어 및 실험 트레이스 간의 차이가 비교적 적은이기 때문에,이 돌연변이가 약하게 translocating 펩타이드로 특징입니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 프로토콜은 내부 지질 vesicles 외부 펩티드의 농도에 상대적인 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 변경 사항은 translocation 능력에 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 약물 전달 벡터로서 잠재력을 지닌 세포 관통 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 관통 펩티드에 대한 흥미가 증가함에 따라, 직접 translocation 이벤트를 측정할 방법이 정량 방식으로 개발하고 사?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 16시에서 18시 1분까지 PG </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 1시 18분 Dansyl PE </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16시에서 18시 1분까지 PC </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> 돼지의 트립신 </td><td> 시그마 </td><td> T - 0303 </td></tr><tr><td> 보먼 - Birk 트립신 / 키모 트립신 억제제 </td><td> 시그마 </td><td> T - 9777 </td></tr><tr><td> 미니 압출기 </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 610,000 </td></tr><tr><td> 암모늄 molybdate (파라) </td><td> 알파 Aesar </td><td> 10,811 </td></tr><tr><td> L - 아스코르비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> 과산화수소, 30 % 용액 </td><td> Mallinckrodt 화학 </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H - 3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S - 9625 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 </td><td> 시그마 </td><td> S - 0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

쉽게 세포막 수용체 1의 도움없이 세포 세포막을 교차 펩티드에 적극적인 관심이 있습니다. 이들의 대부분은 자주 약물 전달 벡터 1-3으로 자신의 잠재력에 대해 설명되어 있습니다 세포 관통 펩티드,라고합니다. 또한, 특히 4,5 이외의 멤브레인 lytic 메커니즘, 세포 용해를 일으키는 않고 박테리아 세포막을 건너 세포내 프로세스 6,7을 방해하여 세포를 죽일 이들을 통해 작동 항균 펩티드의 증가 관심이 있습니다. 사실, 저자는 점점 더 셀 - 관통 및 항균 펩티드 1,8 사이의 관계를 지적했습니다. 멤브레인 translocation과 펩타이드 구조와 이동시키다하는 기능 사이의 관계 과정의 확실한 이해 translocation에 대한 효과적이고 재현성 assays가 필요합니다. 몇몇 그룹은 대형 unilamel로 translocation을 측정하는 방법을 제안했습니다고맙다 지질 vesicles (LUVs) 9-13. LUVs은 박테리아와 진핵 세포 점막에 대한 유용한 모델로 봉사하고 자주 펩타이드 형광 연구 14,15에 사용됩니다. 여기, 우리는 먼저 이러한 magainin 및 buforin II 16,17으로 항균 펩티드를 고려 마츠 및 동료에 의해 ​​개발된 방법은 우리의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법에 대한 우리의 프로토콜을 제공하는 것 외에도, 우리는이 분석을 사용하여 translocation 능력을 quantifies 데이터 분석에 대한 직접적인 접근 방식을 제시한다. 다른 사람에 비해이 translocation 분석의 장점은 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 트립토판 함유 펩티드로, 펩타이드 특성 18을 변경할 수있는 형광 레이블의 추가를 필요로하지 않습니다 가능성을 가지고 있습니다. 간단히, 지질 vesicles로 translocation 능력은 기본 트립토판의 잔류물와 D 사이의 포스터 공명 에너지 전송 (걱정)의 함수로 측정단백질은 외부와 관련된 ansyl phosphatidylethanolamine은 멤브레인 (그림 1) LUV. 그들은 LUVs와 캡슐 노골적인 트립신 발생으로 휴대 관통 펩티드는 LUV 멤브레인 및 신호를 걱정의 드롭에서 disassociation로 이어지는, 죽습니다. 의 드롭 translocating 펩타이드에 대한 관찰 신호가 LUVs이 트립신 및 트립신 억제제, 또는 때 저절로 지질 세포막을 교차하지 않는 펩타이드가 트립신 함유 LUVs에 노출을 모두 포함하는 동일한 펩타이드에 대한 관찰보다 훨씬 큰 무서워. 형광에이 변경 사항은 시간이 지남에 따라 펩타이드 translocation의 직접 부량을 제공합니다.

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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

이 프로토콜 세부 대형 unilamellar 지질 vesicles로 펩타이드 translocation의 양적 측정을위한 방법입니다. 이 방법은 또한 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 효율적이고 자발적 지질 bilayers를 건너되는 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.8K 조회수.  Wellesley College. 이 프로토콜 세부 대형 unilamellar 지질 vesicles로 펩타이드 translocation의 양적 측정을위한 방법입니다. 이 방법은 또한 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 효율적이고 자발적 지질 bilayers를 건너되는 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Metagenomic 도서관 대규모 화면

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

연구

생물학

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

의 형광 단백질의 편광 Translocation XenopusWnt 신호에 응답> Ectoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

대형 Unilamellar 소포와 검사 BCL-2 가족 기능

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...