이 프로토콜의 목표는 골관절염의 발병 및 진행 중 관절 연골의 기계적 특성을 연구하기 위한 체외 모델을 만드는 것이었습니다. 본 기술의 주요 장점은 연골 외식물이 생성되기 쉽고 네이티브 에이지 연골을 매우 대표한다는 것입니다. 이 모델은 생체 역학 수준에서 다양한 골관절염, 진단 및 치료 접근법을 분석하고 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
먼저 메스를 사용하여 뼈에서 연골을 잘라낸다. 생검 펀치를 사용하여 직경 4mm의 디스크를 생성합니다. 맞춤형 절단 장치에 디스크를 놓습니다.
주걱을 사용하여 연골 디스크를 고정하고 안정화합니다. 면도날로 연골 디스크를 자릅니다. 주걱을 사용하여 디스크를 모아 1.5 밀리리터 튜브에 넣으십시오.
연골 샘플에 남아 있으려면 130마이크로리터의 세포 투과성 형광 염료를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 플레이트에 디스크를 웰당 하나의 디스크로 분배합니다. 형광 현미경의 플레이트 홀더에 96 웰 플레이트를 놓습니다. 적절한 형광 필터와 대물렌즈를 선택합니다.
개별 연골이 들어 있는 미리 선택된 웰 아래에 대물렌즈를 놓습니다. 디스크에 초점을 맞추면 세포 패턴을 볼 수 있습니다. 네비게이터 함수를 선택하여 전체 웰에 대한 개요를 확인합니다.
마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 드래그하여 다른 스테이지 위치로 이동합니다. 스캔할 관심 영역을 포함하는 사각형을 선택합니다. 소프트웨어의 포커스 맵 포인트 옵션을 선택한 다음 중앙을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 각 개별 타일을 선택합니다.
이전에 선택한 모든 타일이 있는 나타나는 창에서 포커스 맵 옵션을 선택합니다. 타일을 두 번 클릭하여 표시하고 적절한 초점을 맞춥니다. 그런 다음 Z 설정을 클릭하여 초점 계획을 저장하고 다음 타일로 진행합니다.
각 개별 타일에 대한 초점 계획을 조정한 후 스캔 시작을 눌러 이미지 획득을 시작합니다. 디스크의 상단, 하단, 왼쪽 및 오른쪽에 충분한 생체 적합성 접착제를 추가하여 페트리 접시에 세포 패턴이 포함된 미리 선택된 각 연골 디스크를 고정합니다. L-글루타민이 없는 Leibovitz 배지 2.5ml로 디스크를 덮습니다.
페트리 접시를 AFM 장치 샘플 홀더에 놓습니다. AFM 캔틸레버를 보정하려면 유리 블록 캔틸레버 표면에 놓아 유리 블록 중앙의 광택 처리된 광학 평면에 놓이도록 합니다. 캔틸레버가 매체에 완전히 잠길 때까지 스테퍼 모터 기능을 사용하여 캔틸레버를 100마이크로미터 단위로 내립니다.
원하는 연골 측정 부위를 식별하려면 페트리 접시의 샘플이 없는 깨끗한 영역에서 캔틸레버로 스캐너 접근 방식을 시작합니다. 그런 다음 캔틸레버를 플레이트 바닥에서 1.5mm 떨어진 곳에 집어넣습니다. 명시야(brightfield) 보기에서 형광 보기(fluorescence view)로 전환하고 디스크 상단을 시각적으로 식별할 수 있습니다.
AFM 샘플 홀더를 디스크 중앙으로 정확히 2mm 이동합니다. 스캐너 접근 방식을 실행하여 연골 디스크 표면에 도달하고 캔틸레버를 100마이크로미터 후퇴시킵니다. 힘 거리 곡선을 생성하려면 원하는 측정 부위에 위치한 셀에 초점을 맞춥니다.
실행 버튼을 클릭하여 측정을 시작하고 각 측정 사이트에서 5개의 힘 거리 곡선을 획득합니다. 검사한 곡선을 저장합니다. 영률(Young's moduli)을 추정하려면 분광학 곡선 배치 열기(open a batch of spectroscopy curves) 옵션을 사용하여 분석할 생성된 힘 거리 곡선을 엽니다.
Hertz-fit 모델을 선택한 다음 elasticity-fit 옵션을 선택합니다. 그런 다음 영률(Young's modulus)을 시각화하고 문서화합니다. 푸아송 비율 0.5와 적절한 캔틸레버 팁 반경을 사용하여 조정합니다.
그런 다음 힘 거리 곡선 맞춤을 육안으로 확인하여 정확성을 확인합니다. 압흔 깊이 측정을 위해 데이터 분석 소프트웨어에서 생성된 각 하중 거리 곡선을 열고 해석 프로세스로 Hertz-fit 모델을 선택합니다. 기준선 오프셋 빼기 옵션을 적용하여 수직 처짐 축을 0으로 만들고 오프셋 플러스 틸트 기능을 선택합니다.
접점 찾기 기능을 사용하면 접점을 자동으로 식별할 수 있습니다. 수직 팁 위치 기능을 사용하여 압흔 중 원시 피에조 높이에서 캔틸레버 처짐만을 고려한 거리를 뺍니다. 탄성 맞춤(elasticity-fit) 옵션을 선택하여 처리된 힘 거리 곡선을 표시합니다.
그런 다음 그래프의 영역을 선택하여 수직 팁 위치 축에서 가장 음의 값과 정렬되도록 합니다. XMIN 상자의 매개 변수 탭에서 들여쓰기를 읽고 문서화합니다. 단일 스트링이 포함된 디스크는 중앙값 2.6kg 파스칼로 더 높은 강성 값을 보였으며, 이는 손상되지 않고 건강한 연골 영역을 나타냅니다.
골관절염 발병 및 진행에 따라 AFM 측정은 이중 현에서 42%, 작은 군집에서는 77%, 큰 군집으로 대표되는 진행된 단계에서 88%의 강직도 단계적 감소를 보여주었습니다. 확산 패턴을 포함하는 디스크는 Young의 계수 단일 값의 중요한 변화와 함께 상승된 탄성으로 표시됩니다. 우세한 세포 패턴 조직이 할당된 모든 연골 디스크의 경우, 사용된 설정점과 관련된 압흔 깊이는 강성에 반비례하는 것으로 밝혀졌습니다.
생성된 힘 거리 곡선에서 볼 수 있는 아티팩트는 AFM 캔틸레버와 연골 표면 사이의 최적이 아닌 접촉 또는 페트리 접시에 대한 부적절한 샘플 고정을 나타냅니다. 당사의 연골 외피는 eliza를 통한 단백질 분석, 면역 표지, 웨스턴 모딩 또는 PCR을 통한 유전자 분석과 같은 다양한 분자 생물학적 기술을 사용하여 추가 처리 및 분석할 수 있습니다. 이 방법은 관절 연골에 대한 새로운 치료법의 직접적인 영향을 연구하는 데 사용될 수 있으며 연구자들이 골관절염의 포토마 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
