原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

要約

原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションに関連する最も一般的な問題を特定し、対処するための段階的なアプローチを紹介します。私たちは、変形性関節症によるさまざまな程度の変性を特徴とする天然のヒト関節軟骨外植片の新たな問題を例示しています。

要約

原子間力顕微鏡(AFM)は、現在、生物学的分野におけるマイクロやナノキューを評価するための最も強力で有用な技術の1つであることは間違いありません。しかし、他の微視的アプローチと同様に、方法論的な課題が生じる可能性があります。特に、サンプルの特性、サンプル調製、装置の種類、およびインデンテーションプローブは、望ましくないアーチファクトにつながる可能性があります。このプロトコルでは、健康な変形性関節軟骨外植片だけでなく、変形性関節症の関節軟骨外植片に関するこれらの新たな問題を例示します。この目的のために、まず、組織外植片全体の大規模な2Dモザイク蛍光イメージングにより、変性のさまざまな段階に応じてex vivo関節軟骨椎間板を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を段階的なアプローチで示します。ex vivoモデルの主な強みは、老化した天然のヒト軟骨で構成されており、変形性関節症の早期発症から進行までの変化を調査できることです。さらに、組織調製における一般的な落とし穴、および実際のAFM手順とその後のデータ解析についても説明します。サンプルの調製と処理、高度な縮性によって引き起こされるトポグラフィーサンプルの特性、サンプルとチップの相互作用など、基本的かつ重要なステップがデータ取得にどのように影響するかを示します。また、AFMの最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを克服する方法を説明します。これらの限界に関する知識は、正しいデータの取得、解釈、そして最終的には幅広い科学的文脈への発見の埋め込みにとって最も重要です。

概要

電子機器やシステムの小型化に伴い、マイクロ・ナノベースの技術や機器の急速な発展が加速しています。そのようなデバイスの1つが原子間力顕微鏡(AFM)で、生体表面をスキャンし、ナノメートルスケールとマイクロメートルスケールの両方で地形情報または生体力学的情報を取得できます^1,2。その膨大な機能の中で、このツールは、さまざまな生物学的システムの機械的特性に関する情報を取得するためのマイクロおよびナノインデンターとして操作できます^3,4,5,6。データは、先端部で約1nmと小さくなり得る機械プローブを介して表面と物理的に接触することによって収集^{される7。}次に、試料の結果として生じる変形は、片持ち梁先端のくぼみの深さと試料⁸に加えられた力に基づいて表示される。

変形性関節症(OA)は、関節および周辺組織の関節軟骨の劣化を特徴とする長期の変性慢性疾患であり、骨表面の完全な露出につながる可能性があります。オープンアクセスの負担は相当なものです。現在、65歳以上の女性の半数、男性の3分の1がOA⁹に罹患しています。外傷、肥満、およびその結果生じる関節¹⁰の変化した生体力学は、関節軟骨変性を決定し、これは一般的な最終結果と見なされる。Ganzらの先駆的な研究は、OAプロセスの初期段階には軟骨の生体力学的特性が関与している可能性があると仮定し¹¹、それ以来、研究者はこの仮説を確認してきました¹²。同様に、組織の生体力学的特性は、超微細構造組織、ならびに細胞間および細胞マトリックスのクロストークによって機能的に調整されることが一般的に認められています。いかなる変化も、組織全体の生体力学的機能に劇的な影響を与える可能性がある¹³。今日まで、OA診断は臨床的であり、プレーンフィルムX線撮影に基づいている¹⁴。このアプローチは2つの側面があります:第一に、OAの診断を定式化するための定義された変性カットオフ閾値がないため、状態の定量化が困難になり、第二に、イメージング法は感度と標準化を欠いており、局所的な軟骨損傷を検出できません15,16,17。この目的のために、軟骨の機械的特性の評価は、疾患の病因に関係なくOAの過程で変化するパラメータを記述し、非常に早い段階で組織の機能に直接影響を与えるという決定的な利点を有する。圧痕器具は、組織が圧痕に抵抗する力を測定します。実際、これは新しい概念ではありません。初期の研究は1980年代と1990年代にさかのぼります。この時期、多くの研究により、関節軟骨の関節鏡視下測定用に設計された圧痕器具が軟骨の変性変化を検出するのに適している可能性があることが示唆されました。30年前でさえ、いくつかの研究は、関節鏡検査中に圧縮剛性測定を行うことにより、組織変性中の軟骨表面のin vivo変化をインデンテーション機器が検出できることを実証することができました18,19,20。

関節軟骨のAFMインデンテーション(AFM-IT)は、組織の極めて重要な機械的特性、すなわち硬さに関する情報を提供します。これは、加えられた非破壊荷重と、くぼみのある組織領域²¹の結果として生じる変形との関係を記述する機械的パラメータである。AFM-ITは、巨視的に影響を受けていないコラーゲンネットワークにおける硬さの加齢による変化を定量化できることが示されており、したがって、OA発症に関連する病理学的変化(関節軟骨のアウターブリッジスケールでグレード0)を区別することができます²²。AFM-ITは、軟骨細胞の早期変性を示す画像ベースのバイオマーカーとして、軟骨細胞の空間的組織化に基づいて、定量化だけでなく、最も初期の変性機械的変化を実際に特定できることを示しました。これらの発見は、すでに他の人によって確認されています^23,24。したがって、AFM-ITは、初期の変性変化を診断および特定するための興味深いツールとして機能します。これらの変化はすでに細胞レベルで測定されており、OAの病態生理学的プロセスの理解を再構築しています。

このプロトコルでは、天然の軟骨外植片の準備からAFMデータの取得と処理まで、関節軟骨外植片の完全な組織学的および生体力学的等級付け手順を実証します。ステップバイステップのアプローチにより、2D大型モザイクイメージングとそれに続くマイクロAFMインデンテーションにより、変性のさまざまな段階に応じて関節軟骨組織を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を示します。

現在、AFM-ITは、他の機器技術と同様に、軟骨の生体力学的変化を測定するための最も感度の高いツール^の1つですが7、誤ったデータ収集につながる可能性のある制限と実用的な特殊性²⁵があります。そのために、軟骨外植片のAFM測定中に発生する最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを最小化または克服する方法を説明します。これらには、サンプルの地形的側面と、AFM互換環境でサンプルを安定させることの難しさ、組織表面の物理的特性、およびそのような表面でAFM測定を行うことの難しさが含まれます。また、誤った力-距離曲線の例も示され、それらを引き起こす可能性のある条件が強調されています。また、カンチレバー先端の形状に固有の制限や、データ解析にヘルツモデルを使用することについても説明します。