O objetivo deste protocolo foi criar um modelo in vitro para o estudo das propriedades mecânicas da cartilagem articular durante o início e a progressão da osteoartrite. A principal vantagem da presente técnica é que os explantes cartilaginosos são de fácil geração e altamente representativos da cartilagem nativa da idade. Este modelo pode ser usado para analisar e monitorar várias abordagens osteoartrite, diagnósticas e terapêuticas no nível biomecânico.
Para começar, corte a cartilagem longe do osso usando um bisturi. Usando um punch de biópsia, gere discos de quatro milímetros de diâmetro. Coloque o disco em um dispositivo de corte personalizado.
Usando uma espátula, fixe e estabilize o disco de cartilagem. Corte o disco de cartilagem com uma lâmina de barbear. Usando uma espátula, colete o disco e coloque-o em um tubo de 1,5 mililitro.
Para permanecer nas amostras de cartilagem, adicione 130 microlitros de corante de fluorescência permeável celular a cada poço da placa de 96 poços e distribua o disco na placa como um disco por poço. Coloque a placa de poço 96 no suporte da placa do microscópio de fluorescência. Selecione o filtro de fluorescência apropriado e o objetivo.
Posicione a objetiva abaixo do poço pré-selecionado contendo cartilagem individual. Concentre-se no disco para ver o padrão celular. Selecione a função de navegador para obter uma visão geral de todo o poço.
Use o botão esquerdo do mouse e arraste-o para navegar para uma posição de palco diferente. Selecione um quadrado que englobe a área de interesse a ser digitalizada. Selecione a opção de ponto do mapa de foco do software e, em seguida, selecione cada bloco individual clicando com o botão esquerdo do mouse no centro dele.
Selecione o mapa de foco de opção na janela exibida com todos os blocos selecionados anteriormente. Clique duas vezes em um bloco para exibi-lo e colocá-lo em foco adequado. Em seguida, clique em definir Z para salvar o plano focal e prossiga para o próximo bloco.
Depois de ajustar o plano focal para cada bloco individual, inicie a aquisição de imagem pressionando Start Scan. Fixe cada disco de cartilagem pré-selecionado contendo um padrão celular em placas de Petri adicionando cola biocompatível suficiente nos lados superior, inferior, esquerdo e direito do disco. Cubra os discos com 2,5 mililitros de meio Leibovitz sem L-glutamina.
Posicione a placa de Petri no porta-amostras dos dispositivos AFM. Para calibrar o cantilever AFM, coloque-o na superfície do cantilever do bloco de vidro para que ele fique apoiado no plano óptico polido no centro do bloco de vidro. Abaixe o cantilever em passos de 100 micrômetros usando a função do motor de passo até que ele fique completamente submerso no meio.
Para identificar o local de medição da cartilagem desejado, inicie uma abordagem de scanner com o cantilever em uma área livre de amostra limpa da placa de Petri. Em seguida, retraia o cantilever a 1,5 milímetros de distância do fundo da placa. Alterne da visualização de campo brilhante para a visualização de fluorescência e identifique visualmente a parte superior do disco.
Mova o suporte de amostra AFM exatamente dois milímetros em direção ao meio do disco. Execute uma abordagem de scanner para alcançar a superfície do disco de cartilagem e retrair o cantilever em 100 micrômetros. Para gerar uma curva de distância de força, concentre-se nas células posicionadas no local de medição desejado.
Clique no botão Executar para iniciar as medições e adquirir cinco curvas de distância de força em cada local de medição. Salve as curvas depois que elas forem inspecionadas. Para estimar os módulos de Young, usando a opção abrir um lote de curvas de espectroscopia, abra as curvas de distância de força geradas a serem analisadas.
Selecione o modelo de ajuste Hertz seguido pela opção de ajuste de elasticidade. Em seguida, visualize e documente o módulo de Young. Adapte-se usando a razão de poisson de 0,5 e o raio apropriado da ponta do cantilever.
Em seguida, verifique visualmente o ajuste da curva de distância de força para garantir a correção. Para a determinação da profundidade de indentação, abra cada uma das curvas de distância de força geradas no software de análise de dados e selecione o modelo de ajuste de Hertz como processo de análise. Aplique a opção de deslocamento da linha de base subtrair para zerar o eixo de deflexão vertical e selecione a função deslocamento mais inclinação.
Use a função localizar ponto de contato para identificar automaticamente o ponto de contato. Usando a função de posição vertical da ponta, subtraia a distância que contabiliza apenas a deflexão do cantilever da altura bruta do piezo durante o recuo. Selecione a opção de ajuste de elasticidade para exibir a curva de distância de força processada.
Em seguida, selecione a área do gráfico para que ele se alinhe com o valor mais negativo no eixo vertical da posição da ponta. Na guia de parâmetros da caixa XMIN, leia e documente o recuo. Os discos contendo cordas simples apresentaram maiores valores de rigidez, com mediana de 2,6 quilo pascals, o que é representativo de áreas de cartilagem sadias e não comprometidas.
Com o início e a progressão da osteoartrite, as medidas de MFA mostraram uma forte diminuição gradual na rigidez de 42% em cordas duplas, 77% em pequenos agrupamentos e, finalmente, 88% em estágios avançados representados por grandes agrupamentos. Os discos contendo um padrão difuso apresentaram-se em elevada elasticidade com uma variação importante dos valores únicos do módulo de elasticidade de Young. Para todos os discos de cartilagem com organização do padrão celular predominante, a profundidade de indentação associada ao setpoint empregado mostrou-se inversamente proporcional à rigidez.
Os artefatos observados nas curvas de distância de força geradas são indicativos de um contato subótimo entre o cantilever de AFM e a superfície da cartilagem ou fixação inadequada da amostra à placa de Petri. Nossos explantes de cartilagem podem ser processados e analisados usando uma variedade de técnicas biológicas moleculares, como análise de proteínas via eliza, imunomarcação, moding ocidental ou análise de geração via PCR. Este método pode ser usado para estudar o impacto direto de novas terapias sobre o cartilego articular e pode ajudar os pesquisadores a obter informações importantes sobre os mecanismos de potoma da osteoartrite.
