이것은 R-pass 핵의 세포 표현형과 특징을 모니터링하는 간단한 방법입니다. 또한 R-pass 핵의 안정성에 영향을 미치는 유전적 요인을 찾기 위해 게놈 전체 연구에서 종종 회수될 수 있습니다. 이것은 잘 확립 된 운동 유기체이기 때문에이 기술은 쉽고 인간 세포주 또는 동물 모델을 사용하는 것에 비해 많은 시간과 노력이 필요하지 않습니다.
R- 패스 핵의 응집은 파킨슨 병과 밀접한 관련이 있습니다. R-pass 핵의 안정성에 영향을 미칠 가능성이 있는 단백질 또는 화학 물질은 이 인간화 효모 모델에서 테스트할 수 있습니다. 시작하려면 알파-시누클레인 플라스미드를 포함하는 세포를 선택하기 위해 SD-URA 한천 플레이트에 3개의 단일 콜로니를 패치합니다.
이어서, 3-패치된 효모 형질전환체를 3 밀리리터의 SRD-URA에 접종하여 플라스미드를 함유하는 효모의 선택적 성장을 위해 Gal1 프로모터 및 0.1% 글루코스 하에서 알파-시누클레인의 유도를 억제하기 위한 2% 라피노스로 플라스미드를 함유한다. 접종된 배양물을 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 배양한다. 다음날, 밤새 배양 된 세포를 600 나노 미터에서 0.2의 광학 밀도에 도달 할 때까지 3 밀리리터의 신선한 SRD-URA에 접종합니다.
이어서, 배양물을 분당 200 회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 6시간 동안 배양한다. 분광 광도계를 사용하여 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 샘플을 96-웰 플레이트의 레인 1에 멸균 증류수로 600 나노미터에서 0.5의 광학 밀도로 희석하여 각 배양물에서 세포의 수를 균등화한다.
다음 5개 레인에 160마이크로리터의 멸균 증류수를 추가하여 효모 세포의 5배 연속 희석을 수행하고 각 레인에서 세포를 연속 희석할 때 총 부피가 40마이크로리터가 되도록 합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10마이크로리터를 옮겨 대조군용 SD-URA 한천 플레이트에서 샘플을 추출하고 SG-URA 한천 플레이트에서 샘플을 추출하여 독성을 모니터링합니다. 발견 된 판을 섭씨 30도에서 거꾸로 4 일 동안 배양하십시오.
4일째까지 24시간마다 플레이트의 이미지를 촬영한 다음 눈으로 발견한 균주 간의 성장 차이를 비교하여 데이터를 분석합니다. 균주당 3개의 패치된 효모 형질전환체를 3밀리리터의 SRD-URA에 접종하고 밤새 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 배양합니다. 다음날, 600 나노미터에서 밤새 배양한 세포의 광학 밀도를 측정하고 세포를 총 200 마이크로리터의 신선한 SD-URA와 SG-URA를 96-웰 플레이트에 접종하였다.
세포를 포함하는 최종 부피를 200 마이크로리터로 조정하고, 초기 세포 광학 밀도를 600 나노미터에서 0.05로 조정한다. 마이크로타이터 플레이트에서 프로그램 설정을 조정합니다. 목표 온도를 섭씨 30도, 간격 시간을 15분, 진동 지속 시간을 890초, 진동 진폭을 5mm로 설정하고 600나노미터에서 흡광도로 측정합니다.
모든 균주가 마이크로플레이트 리더에서 고정상에 도달하기 위해 플레이트를 2-3일 동안 배양합니다. 성장 곡선을 플로팅하여 데이터를 분석합니다. 패치된 효모 형질전환체를 3밀리리터의 SRD-URA에 접종하고 분당 200회전으로 교반 하에 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다.
다음날, 밤새 배양 된 세포를 3 밀리리터의 신선한 SRD-URA에 600 나노 미터에서 0.003의 광학 밀도로 재 접종 한 다음 광학 밀도가 0.2에 도달 할 때까지 분당 200 회전으로 교반하에 섭씨 30도에서 배양합니다. 그런 다음 300 마이크로 리터의 20 % 갈락토스를 추가 한 다음 분당 200 회전으로 교반 하에서 섭씨 30도에서 6 시간 더 배양합니다. 800g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 배양액 1 밀리리터를 수집하고 상청액을 버린다.
30마이크로리터의 증류수에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 유리 슬라이드에 아가 로스 겔 패드를 준비하십시오. 세포를 재현탁시키고, 5 마이크로리터의 세포 재현탁액을 유리 슬라이드 상에 로딩하고, 절단된 아가로스 패드를 사용하여 세포를 검사용으로 덮는다.
100x 대물렌즈로 현미경 이미징을 수행하려면 프로그램을 사용하여 이미지를 생성하는 화면 캡처 옵션을 사용하고 명시야를 선택하여 이멀젼 오일을 사용하여 100x 대물렌즈로 셀의 초점을 맞춥니다. GFP 형광 필터로 전환하고 이미지 노출 시간을 50밀리초에서 300밀리초 사이로 조정하여 신호 대 노이즈 비율의 균형을 조정하여 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 이미지 파일을 열고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포의 초점 수를 기준으로 세포를 계수하여 데이터를 분석합니다.
PRS426 벡터에서 Gal1 프로모터 하의 시누클레인 발현은 유도제로서 갈락토오스를 함유하는 한천 플레이트에서 현저한 성장 지연을 보였다. 시누클레인 발현에 의한 성장의 차이는 또한 액체 배양물에서 관찰되었다. 두 배양 조건 모두에서 야생형 시누클레인 및 E46K 또는 A53T 돌연변이가 있는 변이체는 시누클레인 독성으로 인한 성장 결함을 보였다.
그러나, 응집체를 형성하지 않는 synuclein A30p 변이체는 무독성 표현형을 보였다. 심각한 세포 독성을 나타내는 균주는 시누 클레인 응집체의 초점을 보였지만 A30p 변종에서는 독성이 적은 형태의 시누 클레인이 세포 전체에 확산되었습니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 특히 시누클레인 관련 표현형을 모니터링할 때 각 실험에서 동일한 성장 단계의 세포를 사용하는 것이 중요합니다.
형광 현미경 데이터에서 볼 수 있듯이 synuclein은 더 큰 응집체를 형성 할 수 있습니다. 따라서, 원심분리에 의해 간단히 분획될 수 있고, 시누클레인-특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 정량화될 수 있다. 이 기술은 synuclein의 응집에 영향을 미치는 새로운 유전 인자 및 화합물을 찾기 위한 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.
따라서 우리는 파킨슨 병에 대한 새로운 치료 후보를 찾기를 희망합니다.
