Este é um método simples para monitorar fenótipos celulares e características dos núcleos R-pass. Também pode ser frequentemente recuperado em um estudo de todo o genoma para encontrar os fatores genéticos que afetam a estabilidade dos núcleos R-pass. Uma vez que este é um organismo motor bem estabelecido, esta técnica é fácil e não requer muito tempo e esforço em comparação com o uso de linhagens celulares humanas ou modelos animais.
A agregação de núcleos R-pass está intimamente associada à doença de Parkinson. As proteínas ou produtos químicos que provavelmente afetam a estabilidade dos núcleos R-pass podem ser testados neste modelo de levedura humanizada. Para começar, coloque três colônias únicas em uma placa de ágar SD-URA para a seleção de células contendo plasmídeos de alfa-sinucleína.
Em seguida, inocular os transformadores de levedura de três remendas por cepa em 3 mililitros de SRD-URA para o crescimento seletivo de leveduras contendo os plasmídeos com 2% de rafinose para inibição da indução de alfa-sinucleína sob o promotor Gal1 e 0,1% de glicose. Incubar a cultura inoculada a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto. No dia seguinte, inocular as células cultivadas durante a noite em 3 mililitros de SRD-URA fresco até que atinjam uma densidade óptica de 0,2 a 600 nanômetros.
Em seguida, incubar a cultura por seis horas a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto. Meça a densidade óptica a 600 nanômetros usando um espectrofotômetro. Em seguida, diluir as amostras para uma densidade óptica de 0,5 a 600 nanômetros com água destilada estéril na faixa 1 de uma placa de 96 poços para equalizar o número de células em cada cultura.
Realize diluições em série de 5 vezes das células de levedura adicionando 160 microlitros de água destilada estéril às próximas cinco pistas e garanta um volume total de 40 microlitros ao diluir em série as células em cada faixa. Use uma pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de cada poço para detectar as amostras em placas de ágar SD-URA para os controles e placas de ágar SG-URA para monitorar a toxicidade. Incubar as placas manchadas de cabeça para baixo a 30 graus Celsius por quatro dias.
Tire imagens das placas a cada 24 horas até o quarto dia e, em seguida, analise os dados comparando as diferenças de crescimento entre as cepas detectadas pelo olho. Inocular os três transformadores de levedura remendados por cepa em três mililitros de SRD-URA e incubar a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto durante a noite. No dia seguinte, medir a densidade óptica das células cultivadas durante a noite a 600 nanômetros e inocular as células em um total de 200 microlitros de SD-URA e SG-URA frescos em placas de 96 poços.
Ajuste o volume final, incluindo as células, para 200 microlitros e ajuste a densidade óptica inicial da célula para 0,05 a 600 nanômetros. Ajuste as configurações do programa na placa de microtitulação. Defina a temperatura alvo para 30 graus Celsius, o tempo de intervalo para 15 minutos, a duração da agitação para 890 segundos, a amplitude de agitação para 5 milímetros e a medição como absorbância a 600 nanômetros.
Incube a placa por 2-3 dias para que todas as cepas atinjam a fase estacionária em um leitor de microplacas. Analise os dados plotando a curva de crescimento. Inocular os transformadores de levedura remendados em 3 mililitros de SRD-URA e cultivá-los durante a noite a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto.
No dia seguinte, reinocular as células cultivadas durante a noite em 3 mililitros de SRD-URA fresco a uma densidade óptica de 0,003 a 600 nanômetros, em seguida, incubar a cultura a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto, até que a densidade óptica atinja 0,2. Em seguida, adicione 300 microlitros de galactose a 20% e, em seguida, incube por mais 6 horas a 30 graus Celsius sob agitação a 200 rotações por minuto. Recolher um mililitro da cultura celular por centrifugação a 800 g durante 5 minutos e eliminar o sobrenadante.
Ressuscite o pellet celular suavemente em 30 microlitros de água destilada. Prepare uma almofada de gel de agarose em uma lâmina de vidro. Ressuspeite as células e carregue cinco microlitros da ressuspensão celular na lâmina de vidro e cubra as células usando a almofada de agarose cortada para exame.
Para realizar imagens microscópicas com uma objetiva de 100x, use a opção de captura de tela para gerar imagens usando o programa e selecione o campo brilhante para focar a célula com uma objetiva de 100x usando óleo de imersão. Mude para um filtro de fluorescência GFP e ajuste o tempo de exposição da imagem para entre 50 milissegundos e 300 milissegundos para obter uma imagem clara equilibrando a relação sinal-ruído. Abra o arquivo de imagem e analise os dados contando as células com base no número de focos nas células usando um software de análise de imagem.
A expressão de sinucleína sob o promotor Gal1 no vetor PRS426 mostrou retardo de crescimento significativo na placa de ágar contendo galactose como indutor. A diferença no crescimento pela expressão de sinucleína também foi observada em culturas líquidas. Em ambas as condições de cultura, a sinucleína do tipo selvagem e variantes com mutações E46K ou A53T apresentaram defeitos de crescimento devido à toxicidade da sinucleína.
No entanto, a variante de sinucleína A30p, que não forma agregados, apresentou fenótipo não tóxico. As cepas que apresentaram citotoxicidade grave mostraram focos de agregados de sinucleína, mas na variante A30p, uma forma menos tóxica de sinucleína foi difundida por todas as células. Para alcançar resultados reprodutíveis, é importante usar a célula no mesmo estágio de crescimento em cada experimento, particularmente quando você monitora fenótipos associados à sinucleína.
Como mostramos em dados de microscópio fluorescente, a sinucleína pode formar agregados maiores. Portanto, ele pode ser simplesmente fracionado por centrifugação e pode ser quantificado por western blotting usando anticorpo específico de sinucleína. Esta técnica é aplicável para triagem de alto rendimento para encontrar novos fatores genéticos e compostos químicos que afetam a agregação da sinucleína.
Assim, esperamos encontrar novos candidatos terapêuticos para a doença de Parkinson.
