Este es un método sencillo para monitorear fenotipos celulares y características de los núcleos de R-pass. También se puede recuperar a menudo en el estudio de todo el genoma para encontrar los factores genéticos que afectan la estabilidad de los núcleos de R-pass. Dado que es un organismo motor bien establecido, esta técnica es fácil y no requiere mucho tiempo y esfuerzo en comparación con el uso de líneas celulares humanas o modelos animales.
La agregación de núcleos R-pass está estrechamente asociada con la enfermedad de Parkinson. Las proteínas o productos químicos que probablemente afectan la estabilidad de los núcleos de R-pass se pueden probar en este modelo de levadura humanizada. Para comenzar, parche tres colonias individuales en una placa de agar SD-URA para la selección de células que contienen plásmidos de alfa-sinucleína.
Luego, inocular los transformadores de levadura de tres parches por cepa en 3 mililitros de SRD-URA para el crecimiento selectivo de levaduras que contienen los plásmidos con 2% de rafinosa para la inhibición de la inducción de alfa-sinucleína bajo el promotor Gal1 y 0.1% de glucosa. Incubar el cultivo inoculado a 30 grados centígrados bajo agitación a 200 rotaciones por minuto. Al día siguiente, inocule las células cultivadas durante la noche en 3 mililitros de SRD-URA fresco hasta que alcancen una densidad óptica de 0,2 a 600 nanómetros.
Luego, incubar el cultivo durante seis horas a 30 grados centígrados bajo agitación a 200 rotaciones por minuto. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. A continuación, diluya las muestras a una densidad óptica de 0,5 a 600 nanómetros con agua destilada estéril en el carril 1 de una placa de 96 pocillos para igualar el número de células en cada cultivo.
Realice diluciones en serie de 5 veces de las células de levadura agregando 160 microlitros de agua destilada estéril a los siguientes cinco carriles y asegure un volumen total de 40 microlitros al diluir en serie las células en cada carril. Utilice una pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de cada pocillo para detectar las muestras en placas de agar SD-URA para los controles y placas de agar SG-URA para controlar la toxicidad. Incubar las placas manchadas boca abajo a 30 grados centígrados durante cuatro días.
Tome imágenes de las placas cada 24 horas hasta el cuarto día y luego analice los datos comparando las diferencias de crecimiento entre las cepas detectadas a ojo. Inocular los tres transformadores de levadura parcheados por cepa en tres mililitros de SRD-URA e incubar a 30 grados centígrados bajo agitación a 200 rotaciones por minuto durante la noche. Al día siguiente, medir la densidad óptica de las células cultivadas durante la noche a 600 nanómetros e inocular las células en un total de 200 microlitros de SD-URA y SG-URA frescas en placas de 96 pocillos.
Ajuste el volumen final, incluidas las células, a 200 microlitros y ajuste la densidad óptica inicial de la celda a 0,05 a 600 nanómetros. Ajuste la configuración del programa en la placa de microtitulación. Ajuste la temperatura objetivo a 30 grados centígrados, el tiempo de intervalo a 15 minutos, la duración de agitación a 890 segundos, la amplitud de agitación a 5 milímetros y la medición como absorbancia a 600 nanómetros.
Incubar la placa durante 2-3 días para que todas las cepas alcancen la fase estacionaria en un lector de microplacas. Analice los datos trazando la curva de crecimiento. Inocular los transformadores de levadura parcheados en 3 mililitros de SRD-URA y cultivarlos durante la noche a 30 grados centígrados bajo agitación a 200 rotaciones por minuto.
Al día siguiente, vuelva a inocular las células cultivadas durante la noche en 3 mililitros de SRD-URA fresco a una densidad óptica de 0.003 a 600 nanómetros, luego incube el cultivo a 30 grados centígrados bajo agitación a 200 rotaciones por minuto, hasta que la densidad óptica alcance 0.2. Luego agregue 300 microlitros de galactosa al 20% y luego incube durante otras 6 horas a 30 grados centígrados bajo agitación a 200 rotaciones por minuto. Recoger un mililitro del cultivo celular por centrifugación a 800 g durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.
Resuspender el pellet celular suavemente en 30 microlitros de agua destilada. Prepare una almohadilla de gel de agarosa en un portaobjetos de vidrio. Resuspenda las celdas y cargue cinco microlitros de la resuspensión celular en el portaobjetos de vidrio, y cubra las celdas con la almohadilla de agarosa cortada para su examen.
Para realizar imágenes microscópicas con un objetivo de 100x, utilice la opción de captura de pantalla para generar imágenes utilizando el programa y seleccione brightfield para enfocar la celda con un objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión. Cambie a un filtro de fluorescencia GFP y ajuste el tiempo de exposición de la imagen a entre 50 milisegundos y 300 milisegundos para lograr una imagen clara equilibrando la relación señal-ruido. Abra el archivo de imagen y analice los datos contando las celdas en función del número de focos en las celdas utilizando el software de análisis de imágenes.
La expresión de sinucleína bajo el promotor Gal1 en el vector PRS426 mostró un retraso significativo del crecimiento en la placa de agar que contenía galactosa como inductor. La diferencia en el crecimiento por expresión de sinucleína también se observó en cultivos líquidos. En ambas condiciones de cultivo, la sinucleína de tipo salvaje y las variantes con mutaciones E46K o A53T mostraron defectos de crecimiento debido a la toxicidad de la sinucleína.
Sin embargo, la variante de sinucleína A30p, que no forma agregados, mostró un fenotipo no tóxico. Las cepas que exhibían citotoxicidad severa mostraron focos de agregados de sinucleína, pero en la variante A30p, una forma menos tóxica de sinucleína se difundió por todas las células. Para lograr resultados reproducibles, es importante utilizar la célula en la misma etapa de crecimiento en cada experimento, particularmente cuando se monitorean los fenotipos asociados a la sinucleína.
Como hemos demostrado en datos de microscopios fluorescentes, la sinucleína puede formar agregados más grandes. Por lo tanto, puede fraccionarse simplemente por centrifugación y puede cuantificarse mediante western blot utilizando anticuerpos específicos de sinucleína. Esta técnica es aplicable para el cribado de alto rendimiento para encontrar nuevos factores genéticos y compuestos químicos que afectan la agregación de la sinucleína.
Por lo tanto, esperamos encontrar nuevos candidatos terapéuticos para la enfermedad de Parkinson.
