이 프로토콜을 사용하면 동기화된 신진 효모 세포에서 S상 지속 시간을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 빠르고 쉽고 재현 가능한 방법입니다. 또한 기존 프로토콜에서 감지되지 않는 경미한 합성 결함을 감지할 수 있을 만큼 민감합니다.
이 방법은 신진 효모에서 세포주기 조절을 연구하는 많은 연구자들에게 유용 할 것입니다. 이 프로토콜을 시연하는 것은 선임 연구원 인 Nicolas Talarek과 실험실의 박사 과정 학생 인 Juan De Dios Barba Tena입니다. 사카로마이세스 세레비지애 세포를 낮은 세포 농도의 SC 배지 10밀리리터에 접종하여 분당 130회전의 안와 교반과 함께 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다.
다음날, 세포를 20 밀리리터의 신선한 SC 배지에서 10 밀리리터당 10 내지 6개의 세포에 2 내지 3배의 최종 농도로 희석한다. 물에 희석 된 밀리리터 알파 인자 당 1 밀리그램의 40 마이크로 리터에서. 그런 다음 세포를 섭씨 30도에서 배양하고 1 시간 동안 분당 130 회전의 궤도 교반을 수행합니다.
이 단계를 한 번 반복합니다. G1 정지를 모니터링하기 위해 광학 현미경으로 세포를 시각화합니다. 셀의 90 % 이상이 shmoo를 표시하고 나머지는 둥근 고정되지 않은 셀이면 진행합니다.
샘플을 1, 500 G에서 3 분 동안 원심 분리한 다음 진공 피펫으로 상청액을 버리고 세포를 20 밀리리터의 SC 배지에 재현탁시킨다. 이 단계를 한 번 반복합니다. 5 분마다 두 번 1 밀리리터의 세포를 수집하고 EDU 라벨링을 진행합니다.
방출 30 분 후에 400 마이크로 리터의 알파 인자를 첨가하십시오. 1 밀리리터의 세포 배양 물을 10 밀리몰 EDU의 1 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 마이크로 원속 튜브로 옮기고 반전으로 잘 혼합합니다. Pi EDU 이변량 팩트에서 EDU 양성 세포와 EDU 양성 세포를 구별하려면 1 밀리리터의 세포 배양을 1 마이크로 리터의 DMSO가 들어있는 2 밀리리터 마이크로 원속 튜브로 옮깁니다.
흔들리는 수조에서 교반 하에서 섭씨 30도에서 3-5 분 동안 배양하십시오. 100 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 세포를 미세 원심 분리기에서 10, 000 G에서 2 분 동안 펠릿화한다.
진공 피펫을 사용하여 상청액을 제거한다. 세포 펠릿을 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올에 재현 탁시키고 vortexing하여 잘 혼합합니다. 샘플을 가변 속도 로커에서 분당 20 틸트로 최소 1 시간 동안 실온에 두어 세포를 투과시킵니다.
세포를 미세원심분리기에서 10, 000 G에서 2분 동안 펠릿화하고 상층액을 진공 피펫으로 버린다. 세포를 500 마이크로리터의 10% 에탄올과 PBS로 두 번 세척한다. 세포를 마이크로원속에 10, 000 G에서 2분간 펠릿화하고, 상층액을 진공 피펫으로 버린다.
RNase A 및 Proteinase K를 함유 한 200 마이크로 리터의 PBS에 펠릿을 재현 탁하십시오.가끔 흔들면서 섭씨 50도에서 1-2 시간 동안 또는 섭씨 37도에서 밤새 배양하십시오. 세포를 마이크로 원심분리기에서 10, 000 G에서 2분 동안 펠릿화하고 상층액을 진공 피펫으로 버린다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS로 세척한다.
그런 다음 세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버립니다. 세포 펠릿을 200 마이크로 리터의 PBS에 1 % BSA로 재현 탁시킵니다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버리고 1%BSA를 포함하는 300마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 두 개의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 분배하십시오. 첫 번째 튜브는 클릭 반응을 위한 200마이크로리터의 세포 배양으로 구성되어야 하고 두 번째 튜브는 사이톡스 녹색 염색을 위한 100마이크로리터의 세포 배양을 포함해야 합니다.
이어서, 세포를 펠릿화하고 앞에서 입증된 바와 같이 상청액을 버린다. 사이톡스 그린 염색을 위해, 세포 펠릿을 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 이어서 세포 농도에 따라, 10 내지 30 마이크로리터를 300 마이크로리터의 사이톡스 녹색 혼합물을 함유하는 유세포분석기 튜브로 옮긴다.
40-50%의 진폭에서 2초 동안 샘플을 두 번 초음파 처리하여 유세포분석기에서 샘플을 처리할 때까지 어둠 속에 두십시오. 클릭 반응의 경우, 새로 준비된 40 마이크로리터의 아지드 염료 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 어두운 곳에서 실온에서 60 분 동안 배양하십시오.
세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버립니다. 그런 다음 PBS에서 300 마이크로 리터의 10 % 에탄올로 세포를 3 회 세척하십시오. 다음으로 세포를 PBS에 밀리리터당 50 마이크로그램의 100 마이크로리터에 재현탁시키고 어둠 속에서 10분 동안 방치한다.
세포 농도에 따라, 10 내지 30 마이크로리터의 세포 현탁액을 300 마이크로리터의 50 밀리몰 트리스 HCl, pH 7.5를 함유하는 유세포분석기 튜브로 옮긴다. 40에서 50의 진폭에서 2 초 동안 두 번 초음파 처리합니다. 세포 분석기에서 처리 할 때까지 샘플을 어둠 속에 두십시오.
488 나노미터의 여기 청색 레이저와 530 x 30 대역 통과 필터를 사용하여 sytox 녹색 샘플을 판독합니다. 488나노미터의 여기 청색 레이저와 Pi X축의 경우 615 x 20 대역 통과 필터, 640나노미터의 적색 여기 레이저, Y축의 경우 660 x 20 대역 통과 필터를 사용하여 점도표에서 Bavaria Pi EDU 샘플을 읽습니다. 3개의 세포 집단이 이변량 EDU Pi 세포분석기 분석에서 관찰되었다.
섭씨 25도에서 세포 집단의 약 27%가 G1 단계, 29%가 S 단계, 약 44%가 G2 플러스 M 단계에 있었습니다. 동기화된 세포에서, S 페이즈의 지속시간은 사이톡스 녹색 유세포분석기 프로파일 상에서 DNA 함량이 1C에서 2C로 변화된 시간에 기초하여 약 25분일 수 있다. EDU 펄스 라벨링은 S 위상 지속 시간을 정확하게 결정했습니다.
방출 15 분 후, EDU 양성 세포의 분획이 검출되었고, 이는 S 단계의 시작을 나타냅니다. S 단계를 통한 진행은 바이에른 Pi EDU 그래프에서 위쪽과 오른쪽으로 이동하는 세포 구름에 의해 관찰되었습니다. 마지막으로, 방출 후 35 분에 세포의 분획은 EDU 음성이었지만 DNA 양의 두 배는 S 단계가 종료되고 세포가 G2 플러스 M 단계에 있음을 나타냅니다.
관찰된 높은 동시성에도 불구하고, 일부 세포는 방출 후 60분 후에 S 페이즈를 완료하였고, S 페이즈는 방출 후 약 65분 후에 전체 집단에 대해 완료되었다. 완벽한 동기화를 유지하고 세포가 두 번째 S 단계로 들어가는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 세포는 핵 DNA 복제 예측을 모니터링하고 정량화할 수 있는 현미경으로 이미지화할 수 있습니다.
이 기술은 경미한 S 상 결함과 세포주기 기간 결함을 갖는 간과 된 돌연변이를 식별하는 데 도움이됩니다.
