D-루프 포획 및 확장 분석은 유사분열적으로 성장하는 효모 세포에서 상동 재조합 동안 D-루프 형성 및 확장 단계의 편향되지 않은 직접 정량을 허용하는 최초의 방법입니다. 이 생존력 독립적 기술을 통해 BIR 제품만 살펴보면 나중에 역할에서 벗어날 수 없는 D-루프 대사에서 단백질을 연구할 수 있습니다. 앞으로 우리는 BRCA2와 상동 재조합에서 블룸 및 워너 킬로 케이스를 포함한 주요 단백질의 역할을 더 잘 이해하기 위해 이러한 분석을 인간 세포로 전환할 계획입니다.
샘플을 5분 동안 원심분리하여 시작합니다. 펠릿을 2.5 밀리리터의 1x 소랄렌 용액에 다시 현탁시키고 60 x 15 밀리미터의 페트리 접시에 옮깁니다. 가교 제어가 없는 경우 2.5ml의 TE1 용액에 펠릿을 재현탁합니다.
다음으로, UV 광원을 오비탈 셰이커의 상단으로 설정하고 50RPM으로 설정합니다. UV 가교결합제를 사용하여 샘플을 365 나노미터 장파 전구로 가교결합시켰다. 페트리 접시를 UV 광원 아래 1-2cm 아래에 10 분 동안 놓고 미리 식힌 플라스틱 또는 플렉시 유리 판에 부드럽게 흔들어줍니다.
그런 다음 샘플을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 2.5 밀리리터의 TE1 용액으로 페트리 접시를 헹구고 이것을 튜브에 첨가하십시오. 샘플을 5분 동안 원심분리합니다.
상청액을 버리고 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 해동을 위해 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 동시에 건조한 욕조를 섭씨 30도까지 예열하십시오.
1 밀리리터의 스페로 플라 스팅 버퍼에 샘플을 다시 현탁시키고 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 3.5 마이크로 리터의 zymolyase 용액을 넣고 가볍게 두드려 혼합하십시오. 섭씨 30도에서 15 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 3 분 동안 원심 분리하고 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 1 밀리리터 스페로 발링 버퍼에서 샘플을 세 번 세척하고 샘플을 3 분 동안 원심 분리합니다.
1 밀리리터의 차가운 제한 효소 완충액에 샘플을 재현 탁하십시오. 3 분 동안 원심 분리하고 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 세탁을 한 번 반복하십시오.
차가운 1x 제한 효소 버퍼 1ml에 샘플을 재현탁합니다. 샘플을 두 개로 균등하게 나눕니다. 섭씨 4도에서 16, 000 G에서 3 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.
하이브리드화 올리고가 있는 1.4x 제한 효소 버퍼 180마이크로리터에 각 샘플의 한 튜브를 재현탁하고 다른 튜브를 하이브리다이징 올리고가 없는 1.4x 제한 효소 버퍼 180마이크로리터에 재현탁합니다. 샘플을 액체 질소에서 스냅 동결합니다. 얼음에서 샘플을 해동하십시오.
하나의 건조 욕조를 섭씨 65도로, 다른 욕조를 섭씨 37도로 예열하십시오. 샘플 36 마이크로리터를 새로운 마이크로원심분리 튜브와 4 마이크로리터의 1%SDS에 분취하고, 튜브의 측면을 부드럽게 두드려 혼합한다. 섭씨 65도에서 15 분 동안 5 분마다 부드럽게 두드리면서 배양하십시오.
배양 직후 얼음 위에 샘플을 놓습니다. 4.5 마이크로 리터의 10 % Triton X-100을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 각 샘플에 20-50 단위의 고 충실도 EcoR1 또는 HindIII 제한 효소를 추가하십시오.
그리고 섭씨 37도에서 20-30 분마다 부드럽게 교반하면서 1 시간 동안 배양하십시오. 이 시간 동안 건조 욕조를 섭씨 55도로, 수조를 섭씨 16도까지 예열하십시오. 각 샘플에 8.6마이크로리터의 10% SDS를 추가하고 피펫팅과 태핑으로 혼합합니다.
섭씨 55도에서 10 분 동안 배양하십시오. 각 샘플에 80마이크로리터의 10% Triton X-100을 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. ATP가 없는 660마이크로리터의 1x 결찰 완충액, pH 8.0에서 1밀리몰 ATP 및 8단위의 T4 DNA 리가아제를 각 샘플에 추가하고 반전으로 부드럽게 혼합합니다.
섭씨 16도에서 1.5 시간 동안 30 분마다 반전시킵니다. 배양 직후 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 프로토콜에 설명된 대로 DNA 정제 후 2마이크로리터의 정제된 DNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 20마이크로리터 qPCR 반응을 설정합니다.
각 샘플에 대해 5개의 제어 반응과 1개의 정량화 반응을 설정하고 이를 중복으로 실행합니다. 이중 가닥 절단 또는 DSB 유도 2시간 후 DLC 분석 분석은 소랄렌 가교가 중요하며 효율성은 샘플 수집과 qPCR 사이의 시간에 따라 달라진다는 것을 보여주었습니다. ARG4 Cp 값은 가교된 샘플 간에 유사하였으나, 가교결합이 없는 DNA가 더 효율적으로 증폭되기 때문에 가교결합이 없는 샘플에 대해서는 더 낮았다.
모든 샘플에 대해, 분자간 결찰 qPCR 대조군은 범위 내에 있었다. 강력한 DSB 유도는 HO 엔도뉴클레아제 인식 부위를 가로질러 증폭되는 대조군에 대한 낮은 qPCR 신호에 의해 입증되었다. EcoR1 qPCR 대조군에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다.
DLC 신호와 하이브리디징 올리고는 분자간 결찰 대조군으로 정규화하여 계산하였다. DSB 유도 후 6시간째에 수행된 DLE 분석 분석은 ARG4 CP 값이 혼성화 올리고가 있는 샘플과 없는 샘플 사이에서 유사하다는 것을 보여주었다. 분자간 결찰 qPCR 대조군은 혼성화 올리고가 있거나 없는 샘플에 대해 허용 가능한 신호를 나타내었지만 실패한 샘플에 대해서는 더 낮은 신호를 나타냈습니다.
세 샘플 모두에서 강력한 DSB 유도가있었습니다. HindIII 절단은 혼성화 올리고에 의한 제한 효소 부위 복원에 의존하기 때문이다. 폭이 있는 가닥과 없는 올리고 샘플 사이의 절제된 가닥에서 HindIII 절단 부위를 가로질러 증폭에 상당한 차이가 있었습니다.
확장된 가닥 상의 부위를 가로지르는 증폭의 더 작은 차이가 관찰되었는데, 이는 여기서 HindIII 절단도 확장에 의존하기 때문이다. 샘플과 버퍼는 항상 차갑게 유지해야합니다. 샘플은 혼성화 올리고가 있거나 없는 1.4x 저온 제한 효소 완충액에 재현탁한 후 급속 냉동해야 합니다.
D-루프 형성 및 제품 형성에 대한 확장의 다운스트림 효과는 서던 블로팅 또는 유전적 종말점 분석을 사용하여 연구할 수 있습니다. 상동성 검색에 대한 효과는 높은 CP를 사용하여 조사될 수 있다. 염색질-면역침전은 관심 단백질의 모집에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.
