이 프로토콜은 육종 환자의 생존율을 개선하고 전신 독성을 줄이기 위해 적용할 수 있는 열에 민감한 약물과 함께 종양 표적 온열요법의 새로운 전임상 테스트를 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 화학 요법 방출이 가열 된 영역에 국한되어 종양 내에서 약물 방출을 최대화하면서 건강한 조직에서 약물의 전신 방출을 최소화한다는 것입니다. 우리의 방법은 육종을 치료하기 위해 임상적으로 번역될 수 있습니다.
또한, 우리의 연구는 국소 저체온증이 어떻게 면역 체계를 자극하여 신체가 표준 화학 요법과 함께 암을 표적으로 삼을 수 있는지 배우고 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Star Innovation Center의 수석 MRI 물리학자인 Dr.Warren Foltz, 아픈 어린이 병원의 수석 HIFU 물리학자인 Dr.Adam Waspe, 토론토의 아픈 어린이를 위한 병원의 Drake Lab에서 응용 과학 석사 학위를 취득한 Suzanne Wong입니다. 시작하려면 클리퍼를 사용하여 구속된 마우스의 뒷다리를 면도하고 70% 에탄올로 닦습니다.
마이크로 리터 주사기를 사용하여 10 마이크로 리터의 세포 현탁액 용액에 약 10, 000 개의 세포를 흡인합니다. 마우스의 오른쪽 뒷다리를 뻗고 26 게이지 바늘이 달린 마이크로 리터 주사기를 사용하여 허벅지 근육에 일정한 동작으로 세포 현탁액을 주입합니다. 바늘은 좌골 신경에 부딪히지 않도록 주의하면서 대퇴골과 무릎 쪽으로 평행하게 삽입해야 합니다.
바늘을 제거하고 마우스를 두 번째 케이지로 되돌립니다. 매일 동물을 평가하고 촉진을 통해 종양 성장에 대해 뒷다리를 모니터링하십시오. MRI 스캐너를 사용하여 마취된 마우스를 이미지화합니다.
T2 가중 이미지에서 일반 치수와 종양이 나타나는 축 슬라이스의 수를 기록해 둡니다. 초음파가 들어가는 허벅지의 대퇴골과 측면 표면을 기준으로 종양의 위치를 기록하십시오. 소구경 HIFU 시스템을 준비하려면 발전기를 켜고 멤브레인을 트랜스듀서에 놓고 멤브레인이 트랜스듀서 아래로 확장될 때까지 트랜스듀서에 충분한 탈이온수를 채웁니다.
그러나 마우스를 압축할 정도로 단단하지는 않습니다. 변환기 회로의 물을 30분 동안 탈기하여 매체에서 용존 산소를 제거합니다. 마우스를 마취시키고 코 콘으로 옮긴 후 마취하에 깜박임 반사가 없어 손상을 방지하기 위해 각막 윤활제를 눈에 바르십시오.
마우스의 오른쪽 뒷다리를 면도하십시오. 오른쪽 뒷다리 전체를 포함한 면도 부위에 제모 크림을 바릅니다. 열 아래에 마우스를 배치amp 열 조절을 돕기 위해 생물 안전 캐비닛에 있는 동안.
그리고 도포 후 1 분 후에 머리카락과 탈모 크림을 제거하십시오. 마우스를 MRI 썰매의 MRI 호환 노즈콘으로 옮기고 썰매의 3D 프린팅된 마우스 홀더 안에 종양이 없는 면이 아래로 향하고 종양이 우수한 마우스를 놓습니다. 열 램프를 마우스 근처에 두어 따뜻하게 유지하십시오.
필요한 경우, 압축된 초음파 겔 패드 세그먼트로 절단하여 홀더의 바닥을 마우스 라이닝 아래에 두어 홀더의 상단까지 종양을 수평으로 평평하게 합니다. 관련되지 않은 다리를 종양 다리에서 멀리 밀어 넣거나 종양 다리를 구부린 상태에서 뻗습니다. 발이 종양 및 초음파 빔 경로의 근거리 또는 원거리에 있지 않은지 확인하십시오.
식도 온도 프로브를 삽입하려면 식도 프로브를 노즈 콘에 끼우고 마우스의 목을 문지릅니다. 마우스의 코를 위로 기울여 머리를 뻗어 입에서 배까지 직선으로 선을 만듭니다. 열 탐침을 혀 위의 약 0.5cm 정도 마우스의 식도로 밀어 넣고 마우스 코 주위의 노즈 콘을 교체합니다.
썰매 상단에 식도 프로브와 노즈 콘을 고정합니다. 그런 다음 직장 온도 프로브를 삽입하고 테이프로 고정합니다. 필요한 경우 다른 젤 패드를 삽입하고 오른쪽 뒷다리 주위에 눈 윤활제 또는 초음파 젤을 바르면 틈이 생깁니다.
27 게이지 나비 바늘 꼬리 정맥 카테터를 40 마이크로 리터의 데드 스페이스와 테이프가있는 마이크로 튜브에 부착 된 측면 꼬리 정맥에 삽입합니다. 연결 케이블이 있는 호흡 모니터를 마우스 머리 쪽으로 놓아 초음파 변환기의 배치를 방해하지 않도록 테이프로 고정합니다. 두 사람이 준비한 마우스, 마우스 썰매, 마취 라인, 호흡 라인, 꼬리 정맥 카테터 및 열 프로브 코드를 MRI 스캐너에 넣고 MRI 썰매 홀더에 넣습니다.
모든 사람이 검사를 받았으며 강자성이거나 시스템의 강한 자기장 내에서 손상될 수 있는 MR 제품군으로 아무 것도 가져오지 않습니다. HIFU 소프트웨어 운영자가 초기 정렬을 위해 트랜스듀서의 반월판을 종양 바로 위로 이동한 후 종양 위의 털이 없는 피부에 눈 윤활제 또는 탈기된 초음파 젤을 바르고 HIFU 변환기를 종양 부위에 결합합니다. 자동 펌프에서 꼬리 정맥 카테터로 약물 전달 라인을 연결하고 꼬리 정맥 라인과 연결 라인의 데드 스페이스 양을 계산합니다.
MRI 레일의 마우스 HIFU 슬레드를 MRI 중앙으로 밀어 넣고 공기 대류 온난화 장치를 가장 따뜻한 설정에 놓습니다. 공기를 불어넣는 튜브가 MRI 구멍 중앙에 있는 마우스 쪽으로 향하게 하고 테이프로 고정합니다. 온난화 장치는 나중에 초음파 처리 중에 마우스의 과열을 방지하기 위해 가장 낮은 설정으로 바뀝니다.
깊이를 포함하여 초음파 처리 표적화를 위한 종양 위치를 결정하기 위해 축 및 시상 모두의 조사 MR 이미지를 획득합니다. HIFU 소프트웨어를 사용하여 이미지에서 측정한 대로 원하는 이동 거리를 삽입한 다음 화살표 방향을 클릭하여 이동하여 변환기 위치를 적절하게 조정합니다. 또한 드리프트 튜브의 위치를 기록해 두십시오.
필요에 따라 반복합니다. 테스트 샷 온도계 획득 동안 5초 동안 짧은 50밀리볼트 연속 테스트 샷 초음파 처리를 수행하여 각질 평면에서 변환기의 초점 위치를 결정합니다. MR 측량 이미지를 HIFU 소프트웨어 내 초점의 각질 보기에 맞춥니다.
뼈 구조 및 직장과 관련된 종양 위치에 대한 이미지를 검토하고 필요에 따라 변환기 위치를 수정합니다. 9 회 반복 열 이미징 동안 테스트 샷 초음파 처리를 반복하여 최소한의 오프 타겟 가열로 종양 부피에 균일하고 정확한 가열이 있는지 확인합니다. 슬라이스 위치, 변환기 위치 및 조향 깊이를 조정하고 필요에 따라 반복 테스트 샷으로 가열 성능을 확인합니다.
HIFU 처리 모니터링 소프트웨어를 사용하여 이동 거리를 측정한 다음 프로그램에서 그리드 좌표를 변경하여 최종 가열 프로파일 내에서 체온 모니터링을 위한 관심 영역 또는 ROI를 정의합니다. 체온 측정 출력의 드리프트 보정을 위해 드리프트 튜브의 유체 신호 내에서 ROI를 설정합니다. 이 유체 신호가 종양 수준에서 축 방향 계획 이미지 내에서 잘 정의되지 않은 경우 드리프트 튜브 내의 광섬유 온도 프로브에서 직접 출력이 드리프트 보정에 사용됩니다.
체온 측정을 위해 직장 프로브 온도를 기준으로 기준 온도를 입력합니다. 소프트웨어에서 20분 온열요법 치료 사양을 열고 참조 MR 이미지가 수집되고 체온 측정이 시작되면 초음파 처리를 시작합니다. 내장된 PID(Proportional Integrative Derivative) 컨트롤러 소프트웨어를 사용하여 열화상 촬영 중에 20분 동안 처리합니다.
ROI의 온도가 원하는 온도로 따뜻해진 후 1.5분 후에 선택된 약물을 주입합니다. 치료 중 직장 온도가 급격히 상승하고 섭씨 40도를 초과하면 초음파 처리를 중단하고 다시 시작하기 전에 직장 온도가 떨어지도록 하십시오. 치료 완료 후 MRI 구멍에서 마우스를 꺼내 꼬리 정맥 카테터 삽입 부위에서 지혈을 확인하고 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
물을 사용하여 뒷다리에서 초음파 젤과 윤활유를 씻어냅니다. 마우스를 케이지로 옮기고 복구를 모니터링합니다. 열 l을 가리킵니다.amp 회복 중 열 조절을 돕기 위해 케이지의 한쪽 끝에서.
이 온열요법 프로토콜을 사용하여, 뒷다리의 종양은 치료 기간 동안 원하는 설정 온도로 지속적으로 가열될 수 있었습니다. 대표적인 처리 동안 모니터링된 온도가 이 그림에 나와 있습니다. ROI에 있는 모든 복셀의 평균 상위 10번째 백분위수 및 상위 90번째 백분위수 온도가 여기에 표시됩니다.
각 마우스에 대한 ROI 내에서 치료 중 평균 온도를 표준 편차로 최적화 단계 동안 테스트하였다. 전체 평균 온도도 표시됩니다. 온열요법 치료의 성공률 또한 시간이 지남에 따라 향상되었습니다.
치료 성공은 포함 기준에 따라 달라졌다. 즉, 전신 온도, 종양 온도 및 ROI에 따른 변화 및 원위 가열이 없습니다. 여기서 파란색 선은 처리에 성공한 마우스의 백분율을 나타내고 주황색 막대는 처리된 마우스의 수를 나타냅니다.
각 처리는 실험이 수행된 별도의 날짜를 나타냅니다. 추가 연구를 위한 최적의 저체온증 치료 시간을 결정하기 위해 10분과 20분의 두 가지 치료 기간을 테스트했습니다. 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법(HPLC MS)을 사용하여 종양 내 독소루비신의 양을 평가하고 테스트 기간 간의 독소루비신 축적 차이를 정량화했습니다.
결과는 정상 체온 대조군과 비교하여 20분 온도감응성 리포솜 독소루비신과 온열요법 그룹에서 종양 내 독소루비신의 양 사이의 유의성을 입증합니다. 유리 독소루비신 그룹의 종양에서 차이가 관찰되지 않았습니다. 질량을 준비하고 배치할 때 HIFU 빔이 방해받지 않아야 합니다.
빔 경로의 젤 또는 뼈에 있는 기포는 피해야 합니다. 우리는 조직과 혈액을 수집하여 다양한 장기의 약동학 및 독성 수준을 분석하고 치료에 대한 면역 체계의 즉각적이고 지연된 반응을 검사합니다.
