시냅스는 뇌의 기본 계산 단위입니다. 제시된 방법은 시냅스와 그 분자 과정을 연구하고 다양한 뇌 질환에서 어떻게 변경 될 수 있는지 이해하는 간단하고 가치있는 도구입니다. 이 기술은 뇌에서 분리 된 시냅토 솜 구조의 분획을 포함합니다.
이를 통해 연구원은 시냅스에서 구획화될 수 있는 효과를 포착할 수 있습니다. 특정 단백질의 분포 수준과 활성은 또한 시냅스 하 분해능으로 분석 할 수 있습니다. 이 절차는 모든 것이 순조롭게 진행되면 개별 연구원이 완료하는 데 약 11시간이 걸립니다.
이 기술을 한 번도 수행하지 않은 개인은 단계에 익숙하지 않은 사람에게는 자연스럽게 시간이 조금 더 걸리기 때문에 이 절차의 길이에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 실험일의 길이 때문에 샘플이 필요 이상으로 오래 얼음 위에 놓이지 않도록 빠른 조직 수집을 용이하게 할 수 있는 파트너와 함께 해부를 수행하는 것이 좋습니다. 또한 이 실험을 실행하기 전날 버퍼와 벤치탑 재료를 준비하여 필요할 때 모든 것을 쉽게 접근할 수 있도록 하는 것이 좋습니다.
이것은 수집 튜브의 경우 특히 그렇습니다. 총 11 개의 세포 내 분획의 다중 부분 표본은이 절차가 끝날 때까지 수집됩니다. 따라서 이 튜브에 미리 명확하게 라벨을 붙이면 하루가 훨씬 쉬워집니다.
시작하려면 참수 절개에서 두개골 주위 깊이까지 피부 아래에 미세한 가위를 삽입하고 비강 내 봉합사까지 중간 시상 절개를하여 두개골에서 두피를 수축시킵니다. 후두 영역에서 각 측두엽을 향해 작업하면서 근막과 근육을 다듬어 각 외부 음향 고기 너머로 두개골의 외부 표면을 노출시킵니다. 지배적이지 않은 손으로 두피와 측면을 고정하고 다른 손으로 척수가 나가는 것이 보이는 구멍 매그넘의 꼬리쪽에 2mm의 가위를 삽입합니다.
가위가 정수리 뼈의 내부 표면에 도달 할 때까지 정중선 절개를하십시오. 칼날이 두개골의 등쪽 표면과 평행하게 움직이도록 가위의 각도를 변경하십시오. 시상과 전두엽 봉합사를 가이드로 사용하여 정수리 및 전두골을 통해 주둥이로 중간 시상 절개를 계속 진행하고 비강 봉합사 바로 너머 절개를 종료합니다.
다음으로, 비강 전 봉합사에 각 날을 놓고 각 날을 비강 전 봉합사에 위치시키고 하나를 고르게 절단하여 비강 뼈에 3mm 수직 절개를하고 주둥이를 비강 간 봉합사에 수직으로 절개합니다. 측면을 고정하면서 한 쌍의 질감이있는 집게의 한쪽을 사용하여 두개골을 뇌에서 부드럽게 들어 올린 다음 측면 및 복부로 들어 올립니다. 필요에 따라 정중선을 따라 반복 한 다음 전체 뇌 표면이 노출 될 때까지 다른 반구에 대해 반복합니다.
구부러진 집게나 가는 주걱을 사용하여 뇌의 주둥이를 부드럽게 들어 올립니다. 시신경과 뇌신경을 절단하여 두개골에서 절제를 완료하십시오. 500 rpm에서 12개의 위로 아래로 통과하여 얼음 욕조 위에 놓인 유리 다운을 사용하여 뇌를 균질화한다.
조직의 철저한 균질화를 보장하기 위해 각 다운스트로크에서 잠시 멈춥니다. 총 뇌 균질 액을 14 밀리리터 고속 둥근 바닥 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10 분 동안 800G에서 회전시켜 S1이라는 상층액을 얻습니다.S1을 새로운 원심 분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. bicinchoninic acid 분석을 위해 S1의 2 개의 5 마이크로 리터 분취량을 취하고 웨스턴 블롯을 위해 S1의 2 개의 100 마이크로 리터 분취량을 취하십시오.
S1을 섭씨 4도에서 15분 동안 9, 000G에서 스핀시켜 시냅스 소좀 상청액 또는 S2 및 미정제 시냅토솜 펠릿 또는 P2를 얻었다. 비신코닌산 분석을 위해 S2의 10마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯의 경우 S2의 500마이크로리터 분취량 2개를 취합니다. 분취량을 얻은 후 상청액을 폐기하십시오. 섭씨 4도에서 15 분 동안 9, 000G에서 원심 분리 한 후 상층액 S를 얻습니다.2'시냅 토솜을 씻고, P2'상청액을 버리고 P2'를 3 밀리리터의 완충액에 재현 탁하십시오.
비신코닌산 분석을 위해 P2'의 20마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯의 경우 P2'의 100마이크로리터 분취량 2개를 취합니다. 세척된 시냅토좀의 저장성 용해를 위해 9부피의 냉각된 완충액 B를 추가하여 P2'를 재현탁하고 유리 다운 균질화기에서 시냅토솜을 균질화합니다. 샘플을 50밀리리터 캡이 있는 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도의 냉장실에서 튜브 리볼버에서 15분 동안 회전시킵니다.
용해된 P2'at 25, 000 G을 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 용해 상층액 또는 LS1, 및 시냅토솜 막 또는 LP1을 포함하는 용해 펠렛을 얻었다. 비신코닌산 분석을 위해 LS1의 50마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯을 위한 LS1의 400마이크로리터 분취량 2개를 취하십시오. LS1을 캡이 있는 원심분리 튜브에 옮겨 초원심분리합니다.
LS1을 섭씨 4도에서 60 분 동안 100, 000G의 고정각 초 원심 분리 로터로 원심 분리하여 시냅스 세포질 상청액 또는 LS2 및 시냅스 소포 펠릿 또는 LP2를 얻습니다. LP2를 500 마이크로리터의 완충액 A에 재현탁시키고 23 게이지 바늘과 1 밀리리터 주사기를 사용하여 LP 2개를 부드럽게 분쇄합니다. 비신코닌산 분석을 위해 LP2의 10마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯을 위한 LP2의 250마이크로리터 분취량 2개를 취하십시오.
약 30 밀리리터의 LS2를 10 밀리 달톤 컷오프로 원심 필터 장치로 옮기고 섭씨 4도에서 최대 1 시간 동안 5, 000 G에서 회전시켜 LS2를 약 0.5 밀리리터로 농축시킵니다. 이중농축 LS2의 분취량 2개와 웨스턴 블롯의 경우 농축된 LS2의 250마이크로리터 분취량을 취한다. 1 밀리리터의 완충액 B에 LP1을 재현탁하고, 비신코닌산 분석을 위해 LP1의 10 마이크로리터 분취량 2개와 웨스턴 블롯을 위한 LP1의 50 마이크로리터 분취량 2개를 취한다.
나머지 LP1을 최종 부피 7.5 밀리리터로 조정하고 완충액 B와 완충액 C를 사용하여 최종 자당 농도 1.1 몰로 조정 한 다음 재현 된 LP1 7.5 밀리리터를 14 밀리리터 초 원심 분리 튜브로 옮깁니다. LP1을 3.75 밀리리터의 버퍼 D로 조심스럽게 오버레이하고 용액의 상단을 펜으로 표시하십시오. 그런 다음 약 1.25 밀리리터의 버퍼 A로 오버레이하고 마찬가지로 용액의 상단을 펜으로 표시하십시오.
울트라 원심분리를 위한 튜브의 균형을 부피가 아닌 무게로 조정하고 버퍼 A를 10밀리그램 이내로 적가합니다. 스윙 버킷 울트라 원심 분리기 로터에서 섭씨 4도에서 2.5 시간 동안 48, 000G에서 원심 분리하고 손상되지 않은 그래디언트의 이미지를 획득하여 각 자당 계면의 구별과 분별의 성공을 문서화합니다. 320 밀리몰 슈크로스의 표면 층을 조심스럽게 제거하고 800 마이크로리터 부피의 320 밀리몰, 855 밀리몰 슈크로스 계면에서 미엘린 분획을 회수합니다.
튜브 벽에서 원형으로 피펫팅하여 완전한 분획이 수집되도록 합니다. 그런 다음 1000 마이크로리터 부피의 855 밀리몰, 1.1 밀리몰 슈크로스 계면에서 SPM 분획을 회수합니다. 남은 자당을 조심스럽게 흡인하고 200마이크로리터의 버퍼 B에 재현탁하여 미토콘드리아 펠릿을 회수하고 SPM 분획을 두 부피의 버퍼 B로 희석한 다음 3.5밀리리터 원심분리 튜브의 고정각 로터에서 원심분리합니다.
상청액을 버리고 250 마이크로리터의 최종 부피를 위해 완충액 A에 SPM 펠릿을 재현탁시킨다. 비신코닌산 분석을 위해 SPM의 2, 5 마이크로리터 분취량을 취하고 나머지 SPM을 웨스턴 블롯을 위해 반으로 나눕니다. 시냅토좀의 전자 현미경 이미지가 이 그림에 나와 있습니다.
시냅스 전후 구성 요소와 미토콘드리아의 시냅스 소포를 포함하는 시냅스 소포가 여기에 표시됩니다. 분획 순도의 마커를 평가하기 위해 세포하 분획의 면역블롯 분석을 수행하였다. 초기 전체 뇌 균질 액과 비교했을 때, 분석은 시냅스 원형질막 분획에서 n- cadherin, 시냅스 세포질에서 알파 시누 클레인, 시냅스 소포 분획에서 시냅토 피신 및 미엘린 분획에서 미엘린 염기성 단백질의 농축을 밝혀 냈습니다.
분획 순도가 확립되면 정량적 면역 블로팅을 사용하여 관심 단백질의 국소화를 결정하거나 유전자형 또는 치료 간의 단백질 분포 차이를 쿼리할 수 있습니다. 이 절차를 시도 할 때 손상되지 않은 시냅 토솜을 수집 할 수 있도록 세제가없는 유리 제품을 사용해야합니다. 또한 자당 그라디언트를 준비하는 동안 명확한 인터페이스를 얻을 수 있도록 주의하십시오.
이렇게하면 시냅스 원형질막 분획을 성공적으로 분리 할 수 있습니다. 전자 현미경, 면역 블로팅, 단백질체학 및 기타 분자 방법과 같은 시냅스 분획의 품질을 지원하기 위해 다양한 구조 및 기능 분석을 수행할 수 있습니다. 신경 전달 물질 방출 또는 효소 분석은 또한 시냅 토좀의 대사 생존을 돕기 위해 수행 될 수 있습니다.
시냅토솜 구조의 분리는 시냅스 기능 및 구성 분석을 위한 패러다임 전환 기술이었습니다. 신경 퇴행의 초기 시냅스 기능 장애를 볼 때 시냅스 수준에서 분자 변화를주의 깊게 해부하면 이러한 장애의 분자 메커니즘을 탐구하는 데 도움이됩니다.
