이 프로토콜은 세포 외 단백질 유비퀴티니션 수준과 설치류 뇌의 proteasome 활동을 측정하여 세포 활동, 학습 또는 질병에 대한 반응으로 유비퀴틴-프로테솜 활동이 어떻게 변하는지 비교합니다. 이 프로토콜은 동일한 설치류 뇌에서 시냅스, 세포질 및 핵 분획을 수집할 수 있습니다. 손실을 최소화, 그것은 작은 조직 수량 및 기본 실험실 장비와 함께 수행 될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 테일러 맥파든 (Taylor McFadden)이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 설치류 뇌 조직의 수집 및 해부로 이 절차를 시작합니다. 사용된 반구가 각 실험 그룹의 추출 조건에서 균형을 이루도록 합니다.
영하 80도 냉동고에서 관심 지역의 한 반구를 포함하는 1.5 밀리리터 원심분리기 마이크로튜브를 제거하십시오. 메스를 사용하여 냉동 뇌 조직을 2 밀리리터 유리 테플론 균질화제로 옮기. 테플론 튜브에 500 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.
유봉 B를 사용하여, 고체 물질의 가시량이 없을 때까지 15 스트로크로 동일한 조직을 균질화합니다. 각 스트로크 중에 터닝 모션을 사용합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전달합니다.
튜브를 젖은 얼음 위에 놓고 30분 동안 배양합니다. 마이크로 센트심분리기에 튜브를 놓고 섭씨 4도에서 845배g에서 10분간 회전합니다. 완료 후, 조심스럽게 파이펫팅하여 상체를 제거하고 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 배치.
이것은 세포질 분획입니다. 생성된 펠릿에 50마이크로리터의 추출 버퍼를 추가하고 파이펫팅으로 다시 중단합니다. 펠릿을 소용돌이피지 마십시오.
재중단 된 펠릿이 들어있는 튜브를 얼음에 놓고 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 20분 동안 21, 섭씨 456회에서 원심분리합니다. 원심 분리에 따라, 조심스럽게 파이펫팅하여 상체를 제거하고 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 배치.
이것은 핵 분획입니다. 리시스 버퍼 대신 TEVP 버퍼 500 마이크로리터를 사용하는 것을 제외하고 는 이전과 마찬가지로 관심 영역의 한 반구를 균질화합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 균질화된 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다.
샘플을 섭씨 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 000배 g에서 원심분리합니다. 상체를 수집하고 1, 000 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 10 분 동안 10, 000 배 g에서 샘플을 원심 분리합니다.
핵과 큰 파편이 들어있는 원래 펠릿을 폐기하십시오. 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송합니다. 이것은 세포성 분획입니다.
50 마이크로리터의 균질화 버퍼를 펠릿에 추가하고 고체 물질이 보이지 않을 때까지 파이펫팅으로 다시 중단합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 10 분 동안 20, 000 배 g에서 샘플을 원심 분리합니다. 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송합니다.
이것은 조잡한 시냅토소말 막 분획입니다. 분석기를 설정하려면 플레이트 판독기를 섭씨 37도로 미리 떼어 내고 달리기를 버틸 수 있습니다. 360 나노미터로 발산하고 460 나노미터로 방출합니다.
사용되는 96 웰 플레이트가 명확하면 광학 위치를 아래쪽으로 설정합니다. 어두운 96 웰 플레이트를 사용하는 경우 광학 위치를 맨 위로 설정합니다. 30분마다 2시간 씩 스캔하여 운동 실행을 프로그래밍합니다.
키트에 제공된 20S 10X 분석 버퍼를 13.5 밀리리터의 초순수로 재구성합니다. 현재 1X 버퍼에 100 밀리머 ATP의 마이크로리터 14개를 추가합니다. 이것은 크게 샘플에서 proteasome 활동을 향상시키고 분석 신뢰성을 향상시킵니다.
100 마이크로리터의 DMSO로 키트에 제공된 AMC 표준을 재구성합니다. 표준이 빛에 민감하므로 어두운 또는 저조도 조건에서 AMC 표준을 사용하여 단계를 수행합니다. 높은 값부터 낮은 AMC 농도까지 AMC의 표준 곡선을 만듭니다.
이 곡선은 균질화된 샘플에서 프로테아솜 활성의 플레이트 판독기 교정 및 분석에 사용됩니다. DMSO의 65 마이크로 리터와 키트에 제공 된 proteasome 감판을 재구성. 또한 기판이 빛에 민감하기 때문에 어두운 또는 저조도 조건에서이 단계를 수행합니다.
그런 다음 20S 분석 버퍼를 사용하여 새로운 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에서 프로테모성 기판의 1~20 희석을 생성한다. 원하는 시료의 정규화된 양을 96웰 플레이트에 추가합니다. 각 샘플을 복제하여 실행합니다.
필요한 샘플의 양은 조직 준비에 따라 다릅니다. 일반적으로, 10 받는 번째 20 마이크로 그램은 모든 세포 전 분획에 대 한 충분 한. 초순수수로 80마이크로리터에 시료의 양량을 잘 불어넣으세요.
추가된 양은 추가된 샘플의 양에 따라 다릅니다. 두 개의 별도 우물에 80 마이크로리터의 물을 단독으로 추가합니다. 이들은 분석 공백이 될 것입니다.
분석 공백을 포함하여 각각에 20S 분석 버퍼 10 마이크로리터를 추가합니다. 리피터 또는 자동화된 파이펫을 사용하여 우물 전체에서 일관된 분석 볼륨을 보장합니다. 조명을 끄거나 어두운 방으로 들어갑니다.
각 표준에 대해 단일 웰을 사용하여 희석된 AMC 표준 100마이크로리터를 모두 새로운 웰에 추가합니다. 어둠 속에서, 리피터 또는 자동화 된 파이펫을 사용하여 10 마이크로 리터의 희석 된 프로테솜 기판을 샘플 및 분석 공백을 포함하지만 AMC 표준은 포함하지 않는 우물에 추가하십시오. 플레이트 판독기에 접시를 넣고 운동 실행을 시작합니다.
독특한 연결 별 폴리비퀴틴 항체와 함께 다양한 표준 서양 블로팅 프로토콜을 사용하여 설치류 뇌 조직에서 수집된 다양한 세포 외 분획에서 다양한 폴리비퀴틴 태그의 정량화를 수행한다. 일부 유비퀴틴 웨스턴 블롯 이미지는 뚜렷한 대역의 열을 제공하는 반면 다른 이미지는 명확한 선이 거의 없거나 전혀 없는 얼룩 모양의 패턴을 생성합니다. 이미지 유비퀴틴 웨스턴 블롯의 정량화를 위해 전체 분자 표준 사다리를 확장하는 컬럼 주위에 상자를 그립니다.
유비퀴틴 염색이 전체 사다리를 통해 확장되면 상자를 조정합니다. 이것은 lysine 48 수정에 대 한 일반적 이며 세포 전 구획에 걸쳐 광범위 하 게 변화. 마지막으로, 모든 면의 열을 둘러싼 배경의 평균 광학 밀도로 계산되는 배경을 뺍니다.
여기에 동일한 동물의 측면 편도체로부터 수집된 다른 분획에서 프로테솜 활성의 정량화가 도시되어 있다. 시험관 내 프로테아솜 활성 분석 동안, 검출된 상대형 형광 단위는 시냅스 분획, 세포질 분획 및 핵 분획에서 분석의 시작부터 끝까지 증가하였다. 프로테모터어 억제제 베타락은 RfUs가 세션 전반에 걸쳐 변화하는 것을 방지했습니다.
세포 전 형 차이는 동일한 동물의 측면 편도체에서 프로테솜 활성에서 관찰되었다. 시냅스 분획 내의 활동 감소에 대응하는 대조군을 기준으로 훈련된 동물에서 핵 프로테솜 활성의 증가가 검출되었다. 세포질 균 증액 활성 기준선에 남아.
여기에 도시된 링크별 단백질 유비퀴티뉴션의 세포전 차이는 학습 후 같은 동물의 측면 편도체에서 발생한다. 세포질 분획의 감소와 상관되는 학습 후 핵 분획의 전반적인 유비쿼터션이 증가했습니다. 학습 후, 선형 유비쿼터티는 핵 분획에서 증가하지만 세포질 또는 시냅스 분획은 증가하지 않습니다.
흥미롭게도, K63 유비퀴티온은 시냅스 분수의 감소와 상관관계가 있는 학습 후 핵 분획이 증가했습니다. 반면 K48 단종은 학습 후 핵 및 세포질 분획에서 증가했지만 시냅스 분획에서는 그렇지 않습니다. 이 프로토콜은 또한 동일한 동물 내의 다른 단백질의 세포 전체 분포 및 기능을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.
