PHS 기금 (MH51393)는이 일을 지원합니다. 우리가 사용하는 Aplysia의 일부는 연구 자료, NIH의 국립 센터에서 부여 RR10294 아래의 마이애미 대학의 Aplysia을위한 국가 자원에 의해 제공됩니다.

1. 준비하기 <ol><li> 75-100 ML 등장 염화 마그네슘 용액을 주입하여 동물을 마취. 우리는 이미지에 사용 Aplysia은 일반적으로 150-200그램하고 Marinus 과학에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 왁스 대상 접시에 anesthetized 동물을 핀. 주사기 바늘은이 목적을 위해 잘 작동, 멸균 기술은 필요하지 않습니다. 총 포셉 및 표준 가위를 사용하면 동물의 발에 절개를하고 구강 질량을 쉽게받을 수 있습니다. 구강 신경을 찾습니다. 모든 구강 신경을 절단하여 신경을주의 깊게 무료, 스프링 가위와 고급 포셉을 사용합니다. </li><li> 신경을 제거하고 인공 해수를 포함하는 Sylgard 코팅 접시에 배치합니다. 신경을 안정 구강 신경을 통해 몇 곤충 핀을 배치합니다. Desheath 세포 녹화 뉴런을 노출 초 미립 포셉, 봄의 가위, 수 있도록 사용하여 구강 신경절. 그런 다음 15 고급 벌레를 (사용하여 신경을 다시 핀 분utien) 핀. 모든 운동은 영상 중에 문제가 될 것 같은 신경이 곳에서 단단히 개최해야합니다. </li></ol> 2. 전극을 준비 <ol><li> 필라멘트와 유리 모세관 튜브를 사용하여 전극 (예 : WPI TW100F-4)와 풀러를 당겨. 설정은 개별적으로 필요한 저항의 전극을 만드는 데 결정해야합니다. 전극 beveled 할, 또는 5 MOhms에 대해 beveling 단계가 생략 된 경우 경우 3 M KAC로 가득 할 때 (칼륨 아세테이트)의 전극 저항은 10 MOhms에 대한 일반적입니다. </li><li> 주사기와 바늘 microfil를 사용하여 3 M KAc/30 밀리미터 KCl을 포함하는 솔루션 전극의 한 세트를 입력합니다. 이 전극은 전기 생리학을 위해 사용됩니다. </li><li> , 염색의 전극의 뒷면 끝을 찍어하여 칼슘 표시기 염료와 전극의 두 번째 세트를 작성 이전에 약으로 재구성. 500μg 염료 40 μl 증류수. 전극의 끝이 가득했을 때, 다시 4분의 1에 대한 인치 작성좋은 전기적 접촉을 위해 KCl 200 MM와 전극의 끝. </li><li> 이 염료 주입을 용이하게하고 여러 막 침투 의해 수행 피해를 줄여으로는, 베벨 전극을에 유용합니다. 우리는 소금 물 / 알루미나 분말 정지의 스트림을 생성하는 사용자 정의 beveler을 사용합니다. 전극은 홀더에 장착하고 팁은 45 ° 각도에서 스트림을 입력합니다. 저항이 KAC 가득 전극 약 5 MOhm에 도달하면 전극 저항은 지속적으로 모니터링하고 beveling가 종료됩니다. 염료 가득 전극은 시간의 동일한 금액을 beveled 일반적으로 15-20 MOhm의 저항이 있습니다. </li></ol> 3. 칼슘 표시기 염료로드 <ol><li> 전기 생리학의 장비에 대한 준비를 놓고 시각적으로 관심 presynaptic 신경 세포를 찾습니다. 우리 실험의 대부분은 먹이, B21 5, 6시 활용 식별 감각 뉴런으로 이루어집니다. 상대적으로 고정 positioN, 크기 (~ 100 μm)와 B21의 소마의 길쭉한 모양을 찾아 쉽게합니다. </li><li> 칼슘 표시기 염료를 포함하는 전극과 관심의 신경을 찌르. B21의 신원은 이후 시냅스 뉴런 B8를 impaling에 의해 확인 할 수 있습니다. ~ 8 NA 전류와 B21의 탈분극은 스파이크와 B8 7 PSP와을 촉진하는 결과가 게재됩니다. </li><li> 약 30 분 hyperpolarizing 펄스 (일반적으로 -15 없음, 1 Hz에서, 75 % 듀티 사이클)를 전달하여 관심 presynaptic 뉴런에 염료를 주입. 염료 로딩이 성공하면, 신경 세포의 소마는 희미한 핑크 색을 취득합니다. 천천히 뉴런에서 철수하여 염료 함유 전극을 제거합니다. </li><li> 염료가 관심의 뉴런과 시냅스 접촉을 미세 프로세스에 확산 할 수 있도록 약 30 분 동안 준비를 둡니다. </li></ol> 4. 칼슘 이미징 및 Electrophysiological 기록 <ol><li> 이미지 microsc에 준비를 배치ope. 준비 요리는 점토와는 달리, 때 서부 유럽 표준시 끈적 남아 Permagum 씰링 코드 조각과 냉각 플랫폼에 개최됩니다. 고정 무대 현미경은 목표를 이동하여 초점을 맞추고 있습니다. 단계는 자석 마운트 manipulators을 장착 할 수있는 고정 남아 있습니다. 높은 배율이 진동 (특히 측면 운동) 문제를 만들면서, 전체 이미지 설정은 진동 절연 플랫폼에 배치해야합니다. </li><li> 일반 전해질 솔루션을 포함하는 전극과 presynaptic과 postsynaptic 뉴런을 찌르. </li><li> 이미지 칼슘 오렌지에 적합한 필터 블록 (여기 549 나노 미터, 방사 576 nm의) 8을 선택하고 카메라를 조정합니다. 대부분의 과학 CCD 카메라 탐정 아웃 읽는 CCD 셀의 하위 집합을 선택 할 수 있습니다. 또한, 전지 (binned) 결합 될 수있다. 동안 binning 증가 감도, 작은 하위 집합 증가 속도를 선택합니다. 이 두 설정은 함께 노출 시간 결정프레임 속도는 초당 취득 할 수있는 방법을 많은 이미지 즉. 적합 설정됩니다 이미지를 500 X 300 픽셀 (10 배 렌즈와 0.5x 카메라 어댑터를 사용)를 580 X 350 μm 2 영역입니다. 노출 시간 &lt;25 밀리와 올바른 노출을 제공하는 최소한의 금액 조명 강도를 조정 빛 경로에 중립적 인 밀도 필터를 추가합니다. 이러한 설정은 30 Hz의 프레임 속도가 될 - Aplysia에 칼슘 변경을 evoked 이미지 하나의 스파이크에 충분히 빨리이다. 마지막으로, 만 이미징 영역이 밝아 있도록 필드 조리개를 닫습니다. </li><li> 이미징 소프트웨어에서 측정하고자하는 신경 세포의 영역을 표시합니다. 요소 AR 소프트웨어는 이것이 관심 영역 (ROIs)를 배치하여 &quot;시간 측정&quot;절에서 수행됩니다. B21는 양극성 뉴런이며, 이전의 작품은 관심 아홉의의 측면 프로세스 연락처 postsynaptic 신경 증명했다. 우리 일반적으로 이미지 초등, 중등 및 고등 브라뉴런의 각 부분을 통해 투자 수익 (ROI)을 배치하여 측면 과정 nches. 염료 가득 뉴런 옆에 추가 투자 수익 (ROI)은 나중에 다른 모든 데이터 포인트에서 차감되는 배경 값을 제공하는 측정됩니다. </li><li> 카메라의 &quot;프레임 표시 장치&quot;신호가 제공하는 트리거 신호를 기다리 전기 생리학 획득을 (이 실험 스파이크 II)를 지시합니다. 이미지 수집 (요소 AR)을 시작하고, 카메라가 첫 번째 프레임을 데리고 스파이크 II가 자동으로 녹음을 시작합니다. 당신은 또한 간단히 현미경의 카메라 포트에 장착 LED를 켜 1401 전원의 TTL 출력을 사용할 수 있습니다. 이 이후 이미징 및 electrophysiological 데이터를 동기화 할 수있는 신호를 제공합니다. </li><li> 원하는 주파수에서 짧은 depolarizing 현재 펄스의 일련의 주입하여 presynaptic 뉴런을 자극한다. 이 작업 가능성이 successf 여부를 결정하기 위해 (자극 실행 오실로스코프와 함께 예) 각 펄스를 모니터하는 것이 중요합니다ully 생성됩니다. 칼슘 오렌지가 다른 염료에 비해 매우 사진 안정적이지만 발생을 표백 염색 얼마나 확인하는 자극없이 제어 재판을 기록하는 것이 좋습니다. </li><li> 세포 내 칼슘 농도가 조작되는 실험에서, EGTA와 같은 약물은 presynaptic 신경 세포에 도입하고 위에서 설명한 자극 및 데이터 수집 단계는 반복된다. </li></ol> 5. 대표 데이터 분석 <ol><li> 텍스트 파일로 작성하여 이미지 데이터를 (각 투자 수익 (ROI)에 대한 측정 농도 값의 목록) 보냅니다. 스파이크 II의 사용자 정의 스크립트는 텍스트 파일을 가져올 수 있습니다. 이 스크립트는 또한 개별 프로브의 공간이 값을 normalizes 및 배경 프로브의 가치를 차감됩니다. 데이터 포인트는 다음 &quot;가상 RealWave&quot;채널로 전기 생리학 데이터가 함께 꾸몄다 있습니다. 스파이크 II의 &quot;채널 프로세스 / 시간 이동 기능은&quot;정확하게 이미지 데이터 관심 장소를 정렬하는 데 사용됩니다참고로 LED 신호를 사용하여 국세청. </li><li> 퍼센트 변경 등의 값을 구하려면 DF으로 형광의 상대적 변화를 계산하여 영상 데이터를 분석 / F O = (FF O) / F O. F O는 자극시 자극과 F 형광 전에 형광 수준을 나타냅니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 실험의 전체 구조. 실험은 Aplysia의 신경절 준비로 진행됩니다. 세포 내 칼슘의 변화는 iontophoretically presynaptic 신경 세포에 도입되는 형광 염료와 이미징 있습니다. 그 시냅스 전송을 유도하고 모니터링 할 수 있도록 사전 및 postsynaptic 뉴런 그런 다음 날카로운 전극으로 찔려 죽은 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="그림 2" /> <str긴 사연&gt; 그림 2. 칼슘 이미징 및 Aplysia의 구강 신경절에서 확인 뉴런의 세포 내 기록. 신경 B21의 이미징 측면 지점의 (A) 사진입니다. 상자가 관심의 측정 영역을 나타냅니다. B21의 (B1) 세포 자극은 또한 행동 잠재력을 해고 원인 postsynaptic 관심 뉴런 B8 (중간 추적)에서 활동 전위 (하단 추적)과 촉진 postsynaptic 잠재력 (PSP와)를 세상의 시작과 끝. presynaptic 칼슘 형광의 증가는 상단 추적에 표시됩니다. homosynaptic 촉진에 presynaptic EGTA의 (B2) 효과. EGTA는 intracellularly ~ 15분 세포 자극하기 전에 B21에 주입했다. 그것은 EGTA 낮은 농도에서 신경 전달을 억제 할 수있을만큼 빠른 게 느린 행동 칼슘 chelator,라고 생각됩니다. 널리 칼슘 신호와 PSP 진폭의 해당 감소의 감소를 확인합니다. (C) PSP 진폭은 presynaptic calciu 상관 관계m 신호. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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	<li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+synaptic+plasticity.">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li><li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators:+Calcium+green,+calcium+orange+and+calcium+crimson.">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li><li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators:+rapid+transient+response+to+flash+photolysis.">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li><li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2++in+leech+heart+interneurons.">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li><li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia.">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li><li>Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission.">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li><li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation.">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook. , (2005).</li><li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia.">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+38:+A+practical+guide:+Two-photon+calcium+imaging+of+spines+and+dendrites.">Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites.</a> Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).</li></ol>

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

우리는 동시에 세포 내 칼슘 농도를 모니터링하고 신경 전달의 효능을 평가하는 데 사용할 수있는 기술을 보여줍니다. 이 기술은 단기 소성의 다양한 형태가 중재하는 방법을 결정하는 데 유용합니다. 영상은 형광 현미경과 CCD 카메라로 수행됩니다. 대부분의 기능 이미징 세트 업에 비해이 장비 요구 사항은 상대적으로 겸손입니다. 기술은 간단하고 배우기 쉽다. CCD 카메라?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 칼슘 오렌지 </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘 보정 버퍼 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> 신호의 감도와 동적 범위를 테스트하는 데 유용 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 hexahydrate </td><td> 시그마 </td><td> M0250 </td><td> 동물을 마취하는 0.33 M 용액에 사용 </td></tr></tbody></table> 표 1. 시약이 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 장비 명 </td><td> 회사 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> FN-1 똑바로 형광 현미경 </td><td> 니콘 인스트루먼트 </td><td> Narishige과 ITS-FN1 단계 </td></tr><tr><td> NMN-21 manipulators </td><td> Narishige </td><td> 자석으로 무대에 장착 </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 두 CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NIS 요소 AR (버전 3.22) </td><td> 니콘 인스트루먼트 </td><td> 이미징 소프트웨어는 형광 데이터를 수집하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 10X/0.3w 계획 형석 목표 </td><td> 니콘 인스트루먼트 </td><td> 이 물 침지 렌즈는 3.5 mm의 매우 긴 작동 거리가 </td></tr><tr><td> 120 PC 금속 할로겐화물 램프를 X-인용 </td><td> EXFO </td><td> 형광 이미징에 사용 </td></tr><tr><td> LS-DWL 할로겐 램프 </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> 동부 표준시 - CY3 필터 세트 </td><td> 크로마 기술 </td><td>; </td></tr><tr><td> 전원 1401 A / D 변환기 </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td> 샘플링은 3 kHz에서에서 이루어졌다 </td></tr><tr><td> 스파이크 II (버전 7.07) </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td> 소프트웨어는 전기 생리학 데이터를 수집하는 데 사용 </td></tr><tr><td> SEC-10 LX 증폭기 </td><td> NPI 전자 </td><td> 10X headstage와 함께 사용 </td></tr><tr><td> 모델 410 증폭기 </td><td> Brownlee 정밀 </td><td> 신호를 증폭하고 필터링하는 데 사용 </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> 마이너스 K 기술 </td><td> 이미지에 대한 진동 절연 </td></tr><tr><td> 냉각 플랫폼 </td><td> 사용자가 만든 </td><td> 황동 플레이트이를 통해 얼음 물 가변 속도 펌프입니다 </td></tr></tbody></table> 표 2. 장비 사용됩니다.

monitoring changes in the intracellular calcium concentration and synaptic efficacy in the mollusc aplysia

그것은 세포 내 칼슘의 변화는 시냅스 소성 (예를 들어, homosynaptic 촉진) 1의 중요한 형태의 수의 유도를 중재하는 것이 좋습니다되었습니다. 이 가설이 동시에 세포 내 칼슘의 변화와 신경 효능에 변경을 모니터링하여 테스트 할 수 있습니다. 우리가이 세포 내 기록 기술을 칼슘 이미징를 조합하여 수행 할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리 실험은 연체 동물 Aplysia californica의 구강 신경절로 진행됩니다. 이 준비가 실험적으로 유리한 특징을 가지고 : 신경절 쉽게 Aplysia에서 제거 실험 일반 시냅스 연결을 확인하고 정상 이온 채널 유통이 성인 뉴런을 사용 할 수 있습니다. Aplysia에 대한 자연 동물의 낮은 신진 대사 속도와 상대적으로 낮은 온도 (14-16 ° C)로 인해 준비는 오랜 기간 동안 안정적입니다. 이 긴 파장 형광 염료는 칼슘에 바인딩 할 때 우리가 쉽게 iontophoresis를 통해 신경 세포로 &#39;로드&#39;이다 칼슘 오렌지 2의 셀 impermeant 버전을 사용합니다 세포 무료로 칼슘의 변화를. 감지 할 다닐 &quot;&gt;, 형광 강도가 증가. 칼슘 오렌지가 빠른 운동 특성 3는 ratiometric 염료와는 달리 (예를 들어, Fura 2), 영상에 대한 필터 휠을 필요하지 않습니다. 그것은 안정적이고 다른 염료 (예를 들어, fluo-3) 2,4 이하 phototoxic 상당히 사진입니다. 모든 비 ratiometric처럼 이 로딩 및 확산으로 인한 염료 농도의 변화에​​ 대한 계정 수 없기 때문에 염료는 칼슘 오렌지, 칼슘 농도의 상대적인 변화를 나타냅니다. 그러나, 그것은 절대 칼슘 농도를 제공하기 위해 보정 할 수 없습니다. 수직, 고정 무대, 복합 현미경은 초당 30 프레임 주위에 녹화 할 수있는 CCD 카메라로 이미지 뉴런에 사용되었습니다. Aplysia이 시간적 해상도에서세포 내 칼슘 농도에서도 하나의 스파이크 유도 변경을 감지하기에 충분한 이상이다. 샤프 전극을 동시에 식별 사전 및 postsynaptic 뉴런에서 신경 전달을 유도하고 기록하는 데 사용됩니다. 각 시험의 결론에서, 사용자 정의 스크립트가 전기 생리학 및 이미징 데이터를 결합합니다. 적절한 동기화를 보장하기 위해 우리는 현미경의 카메라 포트에 장착 LED에서 빛 펄스를 사용합니다. presynaptic 칼슘 레벨 (세포 EGTA 주입을 통해 예를 들어)의 조작은 우리가 소성의 다양한 형태의 중재에 세포 내 칼슘의 역할에 관한 구체적인 가설을 테스트 할 수 있습니다.

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을 보여줍니다<em&gt; Aplysia</em&gt;. 우리는 이미지 세포 내 칼슘을 형광 염료, 칼슘 오렌지, 그리고 날카로운 (세포) 전극과 신경 전달을 유도하고 모니터링을 사용합니다.

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

10.9K 조회수.  Mt. Sinai School of Medicine. 우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을 보여줍니다 Aplysia. 우리는 이미지 세포 내 칼슘을 형광 염료, 칼슘 오렌지, 그리고 날카로운 (세포) 전극과 신경 전달을 유도하고 모니터링을 사용합니다.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

연구

신경과학

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.