여기서 우리는 참조 단백질에 비해 시냅스 단백질의 분포를 결정하기 위해 면역 형광, 공초점 현미경 및 컴퓨터 기반 분석을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 우리의 방법은 절대 형광 수준이 아닌 비율을 사용하여 면역 형광 얼룩의 내재된 가변성을 우회합니다. 이 방법을 사용하면 다른 수준에서 단백질 분포의 이질성을 분석할 수 있습니다.
전체 뇌 슬라이스에서 뇌 영역, 해마의 다른 층과 같은 하위 영역에 이르기까지. 이 기술은 마우스 이외의 뇌 및 모델 시스템 이외의 다른 조직에서 단백질 분포를 결정하기 위해 적응될 수 있다. 원고에 설명된 대로 이전에 격리되고 고정된 마우스 뇌를 세척하여 시작합니다.
그런 다음 뇌를 15 밀리리터 반응 튜브로 옮기고 30%의 자당 0.1 어금니 PB를 전달한다. 저온을 보호하려면 뇌가 섭씨 48도 또는 가라앉을 때까지 배양합니다. 그 후 날카로운 블레이드를 사용하여 관심 영역에 따라 극저온 보호 뇌를 다듬습니다. 그런 다음 뇌를 냉동고 금형에 넣고 최적의 절삭 온도 화합물을 추가하여 거품을 피하고 뇌를 제대로 방향을 조정하여 절단의 관상 동맥 평면을 갖도록 합니다.
냉동 고체가 동결 될 때까지 영하 80도 냉동고에 냉동 냉동고에 냉동 금형을 배치합니다. 냉동 된 조직을 냉동 마이크로 톤에 장착하고 미세 토메 온도에 평형섹션 전에 적어도 15 분 동안 기다립니다. 25 마이크로 미터 두께의 관상 슬라이스로 뇌를 자르기 시작합니다.
뇌 조직을 건드리지 않고 첫 번째 슬라이스의 10 월에 유리 후크를 신중하게 사용하십시오. OCT는 유리 후크에 충실합니다. 유리 후크를 사용하여 뇌 슬라이스를 첫 번째 우물로 옮기.
0.1 어금니 PB로 채워진 24 개의 웰 플레이트에서 잘 당 3 개의 인접 조각을 수집합니다. 슬라이스를 섭씨 4도에 보관하여 최대 2주 동안 염색할 때까지 보관합니다. 면역 염색을 위한 슬라이스를 준비하려면 플라스틱 파이프를 사용하여 뇌 슬라이스에 그려지지 않고 PB 용액을 잘 제거합니다. 그런 다음 1000 마이크로 리터 파이프를 사용하여 250 마이크로 리터의 신선한 PB를 추가하여 10 월 초과를 씻어 냅니다.
슬라이스를 건조하지 않도록 시간에 각 우물에 대해이 세탁을 반복합니다. 그런 다음 플라스틱 파이프를 사용하여 첫 번째 우물에서 PB 용액을 제거합니다. 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 잘 작동하면 잘 작동할 때 250 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다.
셰이커의 실온에서 플레이트를 3시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 동안 반응 튜브에 잘 당 항체 완충제의 250 마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 2 마이크로리터 파이펫을 사용하여 적절한 양의 항체 파이펫을 용액에 직접 넣고 여러 번 부드럽게 파이프를 섞습니다.
그런 다음 이 희석된 항체를 소용돌이로 사용하여 적절한 혼합을 보장하지 않습니다. 잘 작동 플라스틱 파이프차단 버퍼를 제거하고 잘 당 1 차 항체 용액의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 하룻밤 사이에 셰이커에 접시를 배양합니다.
다음 날 플라스틱 파이펫으로 항체 용액을 제거합니다. 300 마이크로리터의 세탁 버퍼 1개씩 1회 3분 당 실온에서 셰이커로 세척합니다. 세탁 하는 동안, 어둠 속에서 작업, 이전에 1 차 적인 항체와 함께 수행 하는 것과 같은 방식으로 반응 튜브에 몇 두 번째 항체에 대 한 불소를 희석.
세척을 완료한 후 플라스틱 파이펫으로 세척 버퍼를 제거하고 250 마이크로리터의 이차 항체 용액을 잘 첨가합니다. 실온에서 90분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 인큐베이션을 완료한 후 플라스틱 파이프로 항체 용액을 제거합니다.
세탁 버퍼 1개와 동일한 방법으로 2개의 세척 버퍼로 섹션을 세 번 씻습니다. 이 세척 중 DAPI 얼룩을 0.1 어금니 PB로 희석하여 1-2000 농도를 달성한다. 플레이트에서 세척 버퍼를 제거한 후 DAPI 용액 250마이크로리터를 추가하고 셰이커의 실온에서 5분 동안 배양합니다.
플라스틱 파이펫으로 DAPI 용액을 제거한 후 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 웰당 0.1 마이크로리터 PB 500마이크로리터를 추가합니다. 현미경 슬라이드를 스테레오스코프 아래에 놓습니다. 미세 브러시를 사용하여 슬라이드에 0.1 어어 PB 3 방울을 추가합니다.
브러시를 사용하여 슬라이드에 한 방울당 한 조각을 놓고 슬라이스를 평평하게 하고 방향을 지정합니다. 모든 슬라이스가 올바르게 배치 된 후 제대로 종이 조직을 사용하여 여분의 PB를 제거하고 조각을 완전히 건조하지 않고 조심스럽게 건조하십시오. 그런 다음 슬라이드에 중간을 포함시키는 80 마이크로 리터를 추가하고 조심스럽게 커버 슬립으로 커버하여 뇌 슬라이스를 포함시게 됩니다.
슬라이드를 덮어 가벼운 노출을 피하고 연기 후드에서 1~2시간 동안 건조한 다음 공초점 현미경 검사법에 대비할 때까지 섭씨 4도의 현미경 슬라이드 상자에 보관하십시오. 원고에 설명된 대로 다른 채널에 대한 전체 뇌 슬라이스의 가상 조직을 획득 한 후 파일을 클릭하여 모든 단일 채널 또는 하나의 이미지를 FIJI로 로드한 다음 엽니다. 그런 다음 무료 손 선택 도구를 사용하여 DAPI 채널에서 한 반구를 묘사합니다.
편집을 클릭한 다음 선택한 영역의 마스크를 만들기 위해 마스크를 만듭니다. 그런 다음 분석을 클릭한 다음 입자를 측정하여 단일 채널의 평균 형광 강도를 결정합니다. 단일 채널을 선택하여 각 채널의 평균 형광 강도 값을 결정해야 합니다.
그런 다음 단일 채널의 평균 형광 강도를 스프레드시트에 복사합니다. 관심 영역에서 단일 채널에 대한 평균 형광 강도를 결정하기 위해 자유 손 선택 도구로 영역을 설명합니다. 핵을 얼룩지게 하는 DAPI를 염색한 후 핵은 천자 패턴을 가지며 세포 밀도가 높은 영역은 세포 밀도가 낮은 영역보다 밝습니다.
무버 항체로 염색하는 것은 시냅토피신이 더 균일한 분포를 드러낸 두뇌를 통해 밝은 핫스팟 지역 및 조광기 지역을 가진 이질적인 분포를 밝혔습니다. 이미지의 오버레이는 무버 단백질이 시냅토피신을 나타내는 녹색 형광을 비교했음을 나타내는 적색 형광의 차동 분포를 보여 주었다. 정량화 분석 후 반구와 관심 영역 전반에 걸쳐 다른 채널에 대한 형광 강도 값이 무버와 시냅토피신 모두에 대해 결정되었다.
시냅토피신 형광값에 대한 무버 형광값의 비율은 시냅스 소포에 비해 무버의 이질분포를 나타내고 있다. 상대 무버는 반구에 걸쳐 에 비해 관심의 한 영역에서 비율을 풍부하고 백분율로 변환 평균에 비해 관심의 한 영역에 얼마나 많은 무버가 존재하는지 보여 주었다. 상대무버 풍부는 해마의 하위 필드에 있는 다른 층을 위해 결정되었습니다.
관심의 세 영역은 해당 반구의 비율에 각각의 층의 비율을 비교하여 정량화된다. 이 절차는 관심있는 단백질의 세포 분포를 추가로 결정하기 위하여 초분해능 현미경 검사법과 같은 다른 화상 진찰 기술과 쉽게 적응하고 결합될 수 있습니다. 이 기술은 또한 유전자 변형 또는 약물 처리 동물과 같은 다른 모형 시스템에 적용될 수 있습니다.
이것은 다른 실험 조건 또는 종에 걸쳐 비교 접근을 허용할 수 있습니다.
